第十章酶在食品中的应用选读.ppt

第十章 酶在食品分析中的应用 　　主要内容： 　　 1 酶法分析的特点及应用类型　　 2 酶联免疫测定（ELISA） 3 聚合酶链式反应（PCR） 4 酶生物传感器 5 酶抑制率法 酶法分析的发展 酶在定量分析中的应用可以追溯到19世纪中期。当时，曾采用麦芽提取物作为过氧化物酶源，以愈创木酚作为共底物或指示剂测定过氧化氢。 然而，酶法分析真正的发展应归于它在临床实验室中的广泛应用。 酶法分析的发展 如早在1914年临床上就开始采用脲酶测定尿中的尿素，但是在临床实验室中酶分析的真正突破要推迟到1958年，当时转氨酶分析发展成为诊断肝病和心脏病的一个有效手段。 到了20世纪50年代前已有60种物质能借助于酶法分析。近年来，酶法分析发展迅速，广泛应用于临床检验、食品、环境等生物及其它样品的检测。 1. 酶法分析的特点及应用类型 酶的特性 酶在食品分析中的应用类型 1. 去除样品中的杂质。如测定果糖、多糖等。 2. 催化待测物生成新的产物，而这种产物更容易被定量分析。如：淀粉的测定。 3. 测定食品中酶的活性作为食品的指标，如过氧化物酶的测定。 4. 利用酶催化反应所产生的一些信息。如酶联免疫法、酶电极法等。 2 酶联免疫测定（ELISA） 酶联免疫测定（enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA）是继放射免疫测定技术之后发展起来的一项新的免疫学技术。 ELISA自上世纪70年代出现开始，就因其高度的准确性、特异性、适用范围宽、检测速度快以及费用低等优点，在临床和生物疾病诊断与控制等领域中倍受重视，成为检验中最为广泛应用的方法之一。 2.1 ELISA的基本原理 （1）利用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接（或建立关联）。 （2）通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。 它将酶促反应的高效率和免疫反应的高度专一性有机地结合起来，可对生物体内各种微量有机物的含量进行测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。 ELISA试剂盒的组成 完整的ELISA试剂盒包含以下各组分： （1）包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （2）酶标记的抗原或抗体（标记物）； （3）酶作用的底物（显色剂）； （4）阴性和阳性对照品（定性测定），参考标准品和控制血清（定量测定）； （5）结合物及标本的稀释液； （6）洗涤液；（含吐温20磷酸盐缓冲液） （7）酶反应终止液。（常用硫酸） 酶标仪和酶标板 2.2 ELISA的基本类型 随着ELISA在生物检测分析领域的广泛应用，根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，逐渐演变出了几种不同类型的检测方法： 双抗体夹心法 此法常用于测定抗原, 将已知抗体吸附于固相载体, 加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。 间接法 此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。 竞争法 此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。以测定抗原为例, 将抗原吸附于固相载体；加入待测抗原和一定量特异性抗体，使固相抗原与待测抗原二者竞争与抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的抗体与待测抗原含量呈负相关。 2.3 ELISA测定中酶的作用 由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定具有极高的灵敏度。 （1）酶标记的抗体或抗原的制备 酶标记的抗体或抗原是ELISA中最关键的试剂。良好的结合物既保持了酶的催化活性，也保持了抗体或抗原的免疫活性。 酶标记抗体的制备主要有戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法两种方法。酶结合物一般需经离子交换层析或分子筛分离纯化。 （2）常用的酶及底物 为什么辣根过氧化物酶可应用于elisa？ （1）成本低 （2）热稳定性好 （3）显色反应类型多 2.4 ELISA技术在食品分析中的应用 近年来，ELISA因其操作程序的规范化、简单化和检测的高灵敏性，在农药残留、兽药残留、重要有机物污染、生物毒素、食品添加剂和人畜共患疾病病原体的快速检测和分析等食品安全性检测领域正逐步推广应用。 （1）毒素检测 真菌毒素是真菌产生的次级代谢产物，其中的十几种对人类危害较大，它们一般同时具有毒性强和污染频率高的特点。其中毒性最大、致癌能力最强的是黄曲霉毒素。它在自然界中分布十分广泛，黄曲霉常常和其他多种微生物在一起，生长在粮食、油料作物的种子、各种食品和饲料中。 自1977年抗黄曲霉素B1的单克隆问世至今，几乎所有重要真菌毒素如伏马毒素、赭曲毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯酮、