石斑鱼抗菌肽的分离纯化及其活性分析1.doc

石斑鱼抗菌肽的分离纯化及其活性分析（Vibrio harveyi）（Epinephelus bleekeri）18h后，(Staphyloccocus aureus)等革兰氏阳性菌有良好抑制作用，D31（Escherichia coli D31）(V. alginolyticus)等革兰氏阴性菌也有良好抑制效果；利用琼脂糖弥散法，D31有较强抑制作用的蛋白类抗菌物质；AU凝胶上的抗菌组分，利用SDS凝胶检测各抗菌活性组分的分子量大小依次约为10.9KD、10.0KD、8.1KD、7.2KD、6.3KD 关键词：布氏石斑鱼；头肾；抗菌肽；酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳 石斑鱼是海南水产养殖的主要对象，在海水鱼类养殖中占有十分重要的地位。近年来，随着养殖规模不断扩大，石斑鱼病害时有发生，造成养殖石斑鱼等热带海洋鱼类的大量死亡，经济损失巨大。抗生素等化学药物对鱼类病害的防治具有一定效果，但由于其导致诸如药物残留、耐药性和污染环境等问题，限制其在水产养殖中的应用。因此，加快对主要水产养殖品种免疫防御的基础研究，提高养殖鱼类自身抵御病害侵袭的能力，开发新型、天然、无环境污染的新型抗菌药物，是实现水产养殖业健康、可持续发展的重要战略之一。 抗菌肽(antimicrobial peptides，AMP)是一类内源性的，具有广谱抗菌活性的小分子肽，具有作用迅速、抗病原能力强、抗病原谱广、活性稳定、不易产生耐药性以及耐高温和耐高盐等特点，被认为是最有可能替代现有抗生素用于疾病防治的新型抗菌药物。在水产养殖动物病害防治方面具有巨大的应用前景 (刘尊英等, 2007；Ganz, 2003；Brogden, 2005； Liu et al, 2008)。 因此，通过对石斑鱼的抗菌肽进行分离纯化，并对所分离的抗菌肽进行抗菌活性检测，筛选具有强抗病原活性的抗菌肽。研究结果不仅有助于揭示石斑鱼的免疫机制，为控制其病害探索合适方法，还有助于从石斑鱼中发现具有较强活性的新型抗菌肽类，扩展整个鱼类抗菌肽的研究深度和广度，从而为研究具有良好活性且具有开发应用前景的病害控制新药奠定基础，并推动具有自主知识产权的新型抗感染药物和水产养殖业的可持续发展。 1 材料与方法 1.1 实验材料 布氏石斑鱼：2009~2010年从海口市东门市场购买野生的布氏石斑鱼，并于试验室中进行暂养、备用。 1.2 实验方法 布氏石斑鱼腹腔注射浓度为1.2×106CFU/mL哈氏弧菌菌液0.15mL/尾，暂养16-18h。 1.2.2 头肾粗提物的制备 利用丁香酚麻醉氏石斑鱼，取其头肾放入置于冰上的烧杯中，加入等体积的提取缓冲液（1%醋酸、1%蛋白酶抑制剂(PMSF)、0.9%生理盐水），使用玻璃研磨器冰浴下研磨，匀浆缓冲液在100℃条件下水浴5min，4℃下12000 r/min离心90min。上清液即为头肾粗提物，-80℃保存备用。 1.2.3 采用径向扩散法（Radial Diffusion Assay，RDA）对布氏石斑鱼头肾粗提物进行抗菌活性分析[5]。具体为：将测试菌培养后制备成浓度为108CFU/mL的菌悬液；取0.1mL与48~50℃的无菌LB固体培养基10mL快速混匀后倒平板。用直径为2.5mm的打孔器在平板上均匀打孔。向孔中加入待测定样品5μL/孔，37℃培养18~24h，测定各样品抑菌圈直径。 1.2.4 头肾粗提物抗菌活性成分性质分析 利用0.5μL 25mg/mL的蛋白酶K对50μL头肾粗提物在55℃消化处理1h，100℃温浴处理2min使蛋白酶K失活， RDA法检测样品经蛋白酶K处理前后的抗菌活性，根据其活性变化确定该活性成分是否为蛋白类物质。 1.2.5 20mL 48~50℃的LB固体培养基与200μL 108CFU/mL大肠杆菌D31菌悬液和200μL 10mg/mL硫酸链霉素混匀后制平板，用于琼脂糖弥散抗菌试验。 参照Panyim方法[8]制备1 mm酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶 (acid-urea poly-acrylamide gel electrophoresis, AU)，上样量为30μL/每孔，150 V 恒压电泳1h。电泳结束后一块用考马斯亮蓝G-250染色以显示样品组分；另一块凝胶经10 mmol/L 的PBS 洗涤3 次（每次10 min）后，将其平铺于上述已制备好的含菌LB平板上，37℃孵育3 h后取出凝胶，再在37℃孵育15~21h，检测记录平板上抑菌斑的位置。 1.2.6 分子量测定 ，征活性也按照1.2.5的方法进行AU电泳，电泳结束后，切取其中一条泳道的凝胶进行考马斯亮蓝G-250染色，并将染色的凝胶与未染色的凝胶