黄芪总皂甙影响病毒感染心肌细胞肌浆网钙泵活力及其基因表达选读.ppt

黄芪总皂甙影响病毒感染心肌细胞肌浆网钙泵活力及其基因表达The Effects of Astragaloside on Myocardial Sarco/Endoplasmic Ca2+ -ATPase Activity and Its Gene Expression in Virus Infected Cardiomyocytes 无锡市中医医院心血管科 无 锡 市 中 医 研 究 所 陆 曙 病毒性心肌损伤的机制 病毒直接导致心肌损害 细胞免疫尤其是细胞介导的细胞毒作用 自身免疫损伤 这些因素均可引起心肌细胞内游离钙浓度的升高和细胞内钙超载，最终导致心肌细胞的损伤 导致细胞内钙超载的因素 电压依赖性钙通道异常激活 质膜钙泵受损 钠钙交换异常 肌浆网对钙的摄 取与释放功能障碍 线粒体氧化磷酸化功能受损 受磷蛋白(Phospholamban) 肌浆网IP3受体 肌浆网Ryanodine受体 肌浆网钙泵(SERCA) 肌集钙蛋白 肌钙网蛋白 因此探讨肌浆网钙转运蛋白的变化对阐明VMC心肌损伤的机制具有重要的学术价值 病毒性损伤可能与心肌肌浆网钙泵(SERCA)功能障碍有关? 心肌SERCA是将胞内游离钙主动摄入肌浆网内储存的一种钙转运蛋白，对调节降低心肌细胞内游离钙浓度起着重要的作用 文献：抗SERCA抗体可致自身免疫性心肌炎 本文主要内容 用培养的乳鼠心肌细胞，建立病毒感染心肌损伤模型，观察病毒感染时，大鼠心肌细胞SERCA功能及其mRNA表达的变化，并初步探讨中药黄芪的活性成分黄芪总皂甙(Astragaloside, AS)对此的影响。 培养心肌细胞病毒感染心肌损伤模型 材料： 出生1-3天的SD大鼠 CVB3病毒 TCID50为10-6 方法： 心肌细胞培养每瓶细胞为5×106/5ml 病毒感染 加2.5ml含 1000 TCID50 CVB3病毒 标本收集 取培养上清及心肌细胞待检 观测指标：分别于感染后24,48,72,96小时观察 细胞搏动% 细胞病变作用(CPE) 培养上清cTnI含量 培养心肌细胞CPE标准 细胞病变(CPE): 细胞结构模糊，足突短缩或消失，胞浆内有空泡，变暗变圆，皱缩直至破碎、崩解脱离瓶壁 CPE积分表示： 无病变计0分 病变在25%以内，计1分 病变超过25%，计2分 病变超过50%计3分 病变超过75%计4分。 感染CVB3病毒后心肌细胞搏动百分率及CPE变化 感染CVB3后心肌细胞CPE与cTnI的变化 病毒性心肌细胞损伤模型形成 模型组心肌细胞 搏动百分率降低 模型组CPE增高 模型组cTnI升高 病毒性心肌细胞 损伤模型形成 病毒性心肌损伤与肌浆网钙泵障碍 病毒性心肌损伤时，肌浆网钙泵活力的改变 病毒性心肌损伤时，SERCA2 mRNA表达的变化 病毒性心肌损伤时肌浆网钙泵活力的改变 材料：羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)，乙二胺四乙酸酯(EGTA)，三硝基甲苯(TritonX-100)， 对－硝基酚(p-NP)，对－硝基苯磷酸(p-NPP)。 标本：将前述培养的病毒感染心肌细胞，置冰浴中以匀浆缓冲液匀浆待测 方法： 心肌细胞SERCA活力，采用本室改良建立的p-NPP法测定。 统计：数据用 x±s表示，组间比较用t检验。 本室改良建立的p-NPP法测定心肌细胞SERCA活力 反应体系中包含心肌匀浆，20mM Hepes pH 7.4，1mM MgCl2，1mM EGTA，0.01‰TritonX-100，100mM KCl，加或不加0.8mM CaCl2，预温37 ℃10min，加10mM p-NPP37 ℃反应30min,结束时用冷缓冲液(含500mM Triss, 55mM EDTA) 终止反应，在波长410nm处测定pNP生成量，与标准pNP浓度曲线比较，并与反应时间及组织蛋白量相比即得SERCA活力单位(μmol/g pro.min)。 CVB3感染后心肌细胞搏动%与SERCA的变化 病毒性心肌损伤时SERCA2 mRNA 表达的变化 材料 标本:前述病毒感染后96h的培养心肌细胞 主要试剂：AMV 反转录酶, Rnasin , dNTPs, Taq DNA polymerase, [α-32P] dCTP, SERCA2引物, GAPDH引物。 方法 总RNA用异硫氰酸胍一步法提取