流式细胞术原理及应用.ppt

流式细胞检测技术 流式细胞检测技术的原理和方法 流式细胞检测技术的应用 流式细胞相关技术 流式细胞检测技术的发展 从本世纪初开始，科学家们就在不断探索细胞测量技术，1968年斯坦福大学的Bill Bonner等研制出第一台以荧光活化的细胞筛选仪(Fluorescence-activated cell sorter, FACS)。1973年BD公司以FACS的商品名称出品了第一台商业化的流式细胞仪(Flow Cytometer, FCM)。随着单克隆抗体技术的发展，流式细胞仪检测技术已经广泛使用在基础研究和临床实践的各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等领域，对各个学科的发展发挥着重要作用。? 流式细胞术及其应用 流式细胞术的原理和方法 流式细胞术在生物学和医学研究中的应用 流式细胞相关技术 流式细胞仪的工作原理 流式细胞仪包括液流系统、光学系统、分选系统和数据处理系统。待测样本中的细胞或其它生物学颗粒性物质经液流系统单个地流过流式细胞仪中激光照射的区域，细胞受激光的激发产生信号，被仪器中的信号接收器接受并放大，这些放大了的信号经计算机分析处理，并以图表的形式直观地显示出来；通过分选系统还可以将某些类型的细胞群体筛选出来。 信号分析 流式细胞仪产生并分析的信号主要有光散射信号和荧光信号。光散射信号的强弱可以反映细胞的大小、形态及胞浆颗粒化的程度等。依荧光素的不同，用不同波长的光激发，发射出不同波长的荧光，可显示不同的颜色，在不同的实验体系中，这些荧光信号就可以反映不同的细胞生物学特性 荧光信号分析 如用荧光染料(FITC或PE等)标记的单克隆抗体 特异性地与细胞表面的抗原、受体或膜糖蛋白结合，在激光的激发之下，发出一定波长的荧光。荧光信号的强度反映了膜抗原、受体或糖蛋白的相对数量，对荧光信号进行收集分析，就可以实现对细胞亚群和功能等的分析。用DNA染料对DNA进行染色，染料通过一定方式与DNA链结合，在激光的激发下，染料发出荧光，测定荧光的强度，就可得出相对DNA的含量，进而可对细胞周期时相进行分析。用特定的荧光染料还可对细胞钙离子浓度、细胞内pH值以及细胞膜电位等进行测定。? FCM在细胞生物学中的应用 ?1 细胞周期分析 在细胞周期内，DNA含量随时相发生周期性的变化。通过荧光探针对细胞进行相对DNA含量测定，可分析细胞周期各时相的百分比，周期动力学参数以及DNA异倍体。 DNA和RNA特异性染料有PI、EBMI、CA3、HO.33258、HO.33342、DAPI、7-AAD、AO和PY等。通过抗溴脱氧脲嘧啶核苷(BrdUrd)的单克隆抗体也可对DNA进行染色。? 2 细胞内钙离子浓度测定 荧光染料(如Quin-2、Indo-1、Fura-2、Fluo-3和Rhod-2等)通过乙酰甲酯(AE)导入细胞后，与钙离子特异性结合。染料的激活或发射特性与钙离子浓度有关，故可用比例法测得或直接测得的荧光强度得到钙离子浓度的相对值，实际浓度需经校对后获得 3 细胞内pH值测定 荧光染料(BCECF、COFDA、DCH和SNARF等)激发光谱或发射光谱是pH值依赖的。在生理pH值范围内，比例荧光与pH值有很好的线性关系，故可用比例荧光测pH值，实际pH值经校正后获得。? FCM在肿瘤学中的应用 1 肿瘤诊断 DNA非整倍体的出现是癌变的一个重要标志，细胞的增殖能力大小也可反映肿瘤的生物学特征。因此，临床上可利用流式细胞仪进行细胞周期分析和DNA倍性分析，辅助肿瘤诊断，包括监测癌前病变、肿瘤的早期诊断、交界性肿瘤诊断和肿瘤细胞学诊断等各方面。? 2 肿瘤预后估计 通常，异倍体肿瘤恶性度、复发率、转移率和死亡率都较二倍体肿瘤高。已有文献报道，在乳腺、结肠、直肠、前列腺和膀胱肿瘤中，异倍体和/或较高的S期百分比都是不良预后的标志。同样地，在肺癌、头颈部肿瘤、卵巢癌、肾癌、子宫内膜癌、黑色素瘤和白血病中，亦有类似发现。因此在病理组织学分级、临床分期等指标基础上，用流式细胞仪检测肿瘤DNA倍体可更客观地预测预后。? 3 监测癌基因和抑癌基因表达 在肿瘤发生发展过程中的作用 用流式细胞仪可以通过特异性的单克隆抗体监测肿瘤细胞中癌基因表达产物的水平以研究肿瘤调控因素。如有文献报道，p53蛋白在乳腺癌细胞中的表达与肿瘤的预后有关。而ras基因的产物P21蛋白的表达从萎缩性胃炎、癌前病变、胃癌依次增加，证实P21蛋白在癌变过程中参与了重要作用。? 在细胞凋亡研究中的应用 细胞凋亡过程中，由于胞浆和核染色质浓缩，核裂解，产生凋亡小体