普通组织化学1课件.pptVIP

第二章 细胞和组织化学方法 第一节 概念 用显微镜观察其变化者称显微镜细胞组织化学，若用电镜观察者称电镜细胞组织化学，用免疫技术方法则称免疫组织化学或免疫电镜细胞化学。 用细胞和组织化学方法显示细胞组织结构中各种酶的定性、定位、定量则称酶组织化学。 ???? 7、选择的试剂必须是分析纯，对被检测物质或酶应无任何影响；实验所用器皿必须清洁无污染杂质，使用的蒸馏水应为双蒸水。 8、为了保证实验的可靠性、科学性，防止假阳性的发生，必须同时作对照实验。 一、动物的处死 1、麻醉 对小动物可将浸有乙醚棉球与小动物同时密封于玻璃容器。较大动物静脉注射4%戊巴比妥（1ml/kg体重）或腹腔内注射20%氨基甲酸乙酯（5ml/kg体重）。 2、空气栓塞 较大动物如兔，用较大空针从耳静脉将空气一次推入。 3、颈椎脱臼或断头 适用于小动物 4、股动物放血 将动物麻醉，切开股动脉放血。 二、取材 所取组织细胞必须越新鲜越好，防止组织变性、挤压、破碎，组织块不宜太大，光镜标本不超过1cm×1cm×0.3cm,电镜标本约在0.5mm左右，条件允许时应低温操作（0~4℃）。 冰冻切片材料取材后应立即用液氮速冻， -70℃或-40℃低温冰箱保存。 1）、固定的意义 保持细胞与生活时的形态相似，防止自溶与腐败。 保持细胞内特殊的成分与生活状态时相仿：经过固定，细胞内的一些蛋白质等可沉淀或凝固，使其定位在细胞内的原有部位，有利于其后物质的确切定位，对于不同的物质应选用不同的固定剂和固定方法。 便于区别不同组织成分：组织细胞内的不同物质经固定后产生不同的折光率，对染料产生不同的亲和力，经染色后容易区别。 有利于切片：固定剂有硬化作用，使组织硬度增加，便于制片。 2）、固定的要求 既要保持这些物质的精确定位。又要保存它们的反应性。一般来说，新鲜未固定的组织，对于反应性的保持最好，但形态结构的保存差。可溶性物质易于弥散。而经过固定的组织，形态结构的保持较好，但其反应性却随固定程度而减弱，化学物质易丢失，特别是酶易失去活性 不同的固定剂和固定方法会引起不同程度的细胞内蛋白质、粘多糖、脂类、核酸和低分子量物质的损失，因此应根据研究目的的不同选择合适的固定剂和固定方法，以使所研究的物质损失达到最小。 固定液的量要足，一般应为组织块总体积的4~5倍，而且应在组织取下后立即或尽快放入适当固定液中。组织块的大小、固定时间、固定温度都应考虑。 3）、固定剂的种类和作用 用于固定组织的化学物质称为固定液或固定剂。 1、按组成分类 一般由单一化学物质组成者称为固定剂或单纯固定液。由多种化学物质混合组成者称为混合固定液或复合固定液。常用的单纯固定液和混合固定液介绍如下： 甲醛 是一种易挥发液体。市面上出售的为40%的甲醛水溶液，也称为福尔马林。一般作为固定剂使用的10%的甲醛，是用水和40%甲醛（9：1）混合而成，实际上是4%甲醛。 甲醛水溶液渗透能力强。固定均匀，组织收缩小，但经乙醇脱水后收缩较大。甲醛通过使蛋白质分子发生交联而产生固定作用。 重铬酸钾 红色结晶，具有毒性，常用其1%~3%水溶液作为固定剂。 可以使蛋白质变为不溶性。保持其生活时的状态，对于细胞质的固定较好，并且可固定类脂类物质使其不溶于脂溶剂。 苦味酸 为黄色结晶，是一种强酸，易燃易爆，常用其饱和溶液作为固定剂。 能沉淀一切蛋白质，穿透慢，组织收缩明显，但组织无明显硬化。对脂肪为类脂无固定作用。 丙酮 为易挥发易燃的无色液体，可与水、醇、氯仿和醚等混合。 可使蛋白质沉淀，渗透力强，对核的固定差。广泛用于酶组织化学方法中各种酶的固定。 Bouin液 是一种常规用于外科活检标本固定的良好固定液。用于固定大多数器官和组织，固定效果好，组织细胞结构完整。细胞核着色鲜明，但细胞质着色较差。 配方：饱和苦味酸水溶液：甲醛水溶液：冰醋酸=15：5：1 Carnoy液 固定胞浆和细胞核，对于染色体固定佳，显示DNA和RNA效果好，也常用于糖原和尼氏体的固定。但不能保存脂类。 配方：冰醋酸10ml，氯仿30ml，无水酒精60ml。 Zenker液 为形态学研究常用的固定液。可用于固定多种组织，使细胞核和细胞质染色较清晰。 配方：储存液由重铬酸钾2.5g，升汞5g，蒸馏水100ml组成，用时加入冰醋酸5ml。 第三节 常用的组织化学定量术 组织化学是以反应产物做定位和定性研究，以往常用“＋”号表示，一般分为０～+ + + + + 五个等级，这种方法没有明确的客观指标，误差较大，特别是对于差别小的样品更无法准确判断。 　　 随着生命科学研究的不断深入，定量技