生物化学第7章蛋白质的分离、纯化和表征幻灯片.pptVIP

第7章 蛋白质的分离、纯化和表征 一、蛋白质的酸碱性质 蛋白质的等电点和等离子点 二、蛋白质分子的大小与形状 根据化学组成测定最低分子量 根据化学组成测定最低分子量 渗透压测定的示意图 Van’t Hoff 公式 渗透压法测定蛋白质的分子量 渗透压法测定蛋白质的分子量 沉降分析法测定蛋白质的分子量 超速离心机工作原理 被离心分子的受力分析 沉降速度法Ⅰ 沉降速度法Ⅱ 沉降速度法Ⅲ 沉降速度法Ⅳ 沉降速度法Ⅴ 沉降速度法Ⅵ 氨基酸残基的偏微分比容 沉降平衡法测蛋白质的分子量 沉降平衡法Ⅰ 沉降平衡法Ⅱ 沉降平衡法Ⅲ 沉降平衡法Ⅳ 三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 蛋白质的胶体性质Ⅰ 蛋白质的胶体性质Ⅱ 蛋白质的沉淀Ⅰ 蛋白质的沉淀Ⅱ 四、蛋白质分离纯化的一般原则 不同离心场下沉降的细胞组分 五、蛋白质的分离纯化方法 根据分子大小不同的纯化方法透析（dialysis）和超滤（ultrafiltration） 根据分子大小不同的纯化方法（密度梯度离心） 柱层析装置图 根据分子大小不同的纯化方法 凝胶过滤层析的原理 凝胶过滤层析的洗脱曲线 凝胶过滤法测蛋白质的分子量 利用溶解度差别的纯化方法(等电点沉淀 ) pH和离子强度对β乳球蛋白溶解度的影响 利用溶解度差别的纯化方法(盐溶和盐析 ) 在等电点时中性盐对一氧化碳血红蛋白溶解度的影响 利用溶解度差别的纯化方法（有机溶剂分级分离法） 根据电荷不同的纯化方法(电泳 ) 根据电荷不同的纯化方法(电泳） 电泳的介质 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶 平板电泳装置 平板电泳装置和蛋白质电泳染色结果 圆盘电泳装置 毛细管电泳装置 SDS测蛋白质的分子量 SDS测蛋白质的分子量 SDS测蛋白质的分子量 等电聚焦 等电聚焦 双向电泳 大肠杆菌蛋白质双向电泳染色结果 离子交换层析Ⅰ 阳离子交换介质 阴离子交换介质 离子交换层析Ⅱ 离子交换层析Ⅲ 离子交换结合洗脱原理 梯度混合器 层析聚焦 利用选择性吸附的纯化方法 利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法 亲和层析原理 高效液相层析和快速蛋白质液相层析 自动部分收集器 六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 蛋白质含量测定Ⅰ 蛋白质含量测定Ⅱ 蛋白质含量测定Ⅲ 蛋白质含量测定Ⅳ 蛋白质纯度鉴定 蛋白质分子上具有各种阴阳离子基团，在一定的pH下，蛋白质分子带有净正电荷或净负电荷，它们可与离子交换剂上的相应基团进行离子交换，使蛋白质分子通过静电引力吸附到离子交换剂上。改变pH和（或）离子强度又可将这些吸附的蛋白质洗脱下来。 在一定的上样和洗脱条件下，因不同的蛋白质分子所带的净电荷和电荷密度不同，分子大小也不同，它们与离子交换剂的结合力不同，结合力较弱的先洗脱下来，结合力较强的后洗脱下来，从而达到分离的目的。洗脱可分单一溶液洗脱、阶段洗脱和梯度洗脱，既可以改变洗脱液的离子强度，也可以改变pH，也可以两者同时改变。 K=VM / VR 用特种多缓冲液（polybuffer）淋洗层析柱中的特种多缓冲交换剂（polybuffer exchanger），就会在柱中产生一个由上而下的pH梯度。随着pH梯度向下移动，达到等电点的蛋白质将顺序被洗脱下来。 1．羟基磷灰石层析：羟基磷灰石即结晶磷酸钙（Ca10(PO4)6(OH)2），它能吸附蛋白质，加大离子强度可将蛋白质洗脱下来。 2．疏水作用层析：疏水层析介质有丁基琼脂糖、苯基琼脂糖、辛基琼脂糖等，蛋白质分子通过疏水作用与层析介质结合，通过能减弱疏水作用的洗脱液将不同蛋白质分别洗脱下来。 将能与目的蛋白特异结合的配体偶联到基质上，在适当的条件下，将蛋白质混合物上样，目的蛋白结合在柱中，而杂蛋白直接流出。经洗柱(washing)后，换用能减弱目的蛋白与配体结合力的洗脱液，将目的蛋白洗脱(eluting)。 （亲和层析） 分离纯化的原理与柱层析相同，只是用全自动的仪器操作，它们有更高的效率、更高的分辨率和更快的过柱速度。 1．前处理：先尽量除去不必要组织和部分，破碎细胞使蛋白质释放出来，加提取液溶解出蛋白质，离心得到粗提液。若要提取某细胞器中的蛋白质，也可通过差速离心先得到细胞器，再提取。 2．粗分级分离：沉淀法、超滤法。 3．纯化：运用各种方法除去杂质。 核糖体 3~10h 100,000 溶酶体、细菌细胞碎片 30 30,000 线粒体、细菌 20 15,000 叶绿体、细胞碎片、细胞核 10 4,000 真核细胞 5 1,000 沉降的组分 时间(min) 相对离心场(g) 透析 超滤 磁力搅拌器 搅拌子 透析液 装有蛋白溶液的透析袋 常用于生成密度梯度的介质是蔗糖、聚蔗糖（Ficol