蛋白酶K标准征求意见稿编制说明（2016-11-20）.doc-中国标准化研究院.doc

蛋白酶K 编 制 说 明 （征求意见稿） 一、任务来源T-424”。本项任务由中国标准化研究院提出并归口，定于2016年完成。本标准起草工作组由中国标准化研究院、河北农业大学、浙江工商大学等单位共同组成。 二、及意义 丝氨酸蛋白酶是一类裂解肽键的蛋白酶，其活性中心的亲和氨基酸为丝氨酸，它们在生物有机体中起着重要而广泛的生理作用。丝氨酸蛋白酶超家族被分为胰蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶两个大家族，蛋白酶KEC 3.4.21.14）属于枯草杆菌蛋白酶家族，是由林伯氏白色念球菌（Tritirachium album Limber）产生的一类主要蛋白酶。因其能消化角蛋白（keratin），故将其称作蛋白酶K。蛋白酶K拥有典型的丝氨酸活性位点：Asp39-His69-Ser224。蛋白酶K具有稳定的结构、极高的酶活力和广泛的底物特异性，但偏好于带有脂肪族及芳香烃的肽链，能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸羧基端连接的肽键，因而被广泛应用于工业、农业和科学研究领域，也因此吸引了来自学术界、工业和农业团体的研究兴趣。 通过研究制定基因工程常用蛋白酶K国家标准，有利于加快分子生物学实验的速度、提高分子生物学实验结果的可靠性和可重复性，从而提升整体分子生物学研发水平，产生广泛的社会效益。建立我国独立自主的蛋白酶K工业系统，即可创造出可观的经济效益又能解决我国目前主要依赖国外进口蛋白酶K的问题，突破国内生物技术酶产业发展受制于人的瓶颈。要对所检测的产品或相关过程的特性进行符合性判定，就需要制定技术标准。要对产品或相关过程的特性进行定量检测，就需要依据经过科学评估的、可重复的、公认的检测方法。目前，基因工程进步如此之快，对相关的定性定量分析方法进行全面的分析方法的验证非常有必要，只有可靠稳定的系列检测方法才能得出可靠的结果，才能保障这一新兴的产业健康发展。 在我国涉及蛋白酶的现行国家标准中，提供的具有普适性，针对性差。这就导致不同厂商的蛋白酶K酶活力单位定义不统一，从而无法对产品质量做出准确的判定，继而影响到其合理的使用。因此，亟待系统研究并确定蛋白酶K，以建立蛋白酶K的相关标准。 三、标准制定原则及主要内容 （一）标准编制原则 标准的制定过程中采用文献调查法、专家座谈法、科学试验法等多种研究方法，方法科学先进、过程周密严谨、数据真实可信、结果明确。 本标准是为相关组织的蛋白酶K检测提供技术支撑，考虑到生产、监管等不同需求，在方法选择上，主要基于产业现状、现有成熟的技术以及试验结果验证基础确定的，因此实用性较强。 （二）标准制订主要依据 1、标准编写遵循GB1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则》的有关要求。 2、标准编写内容参考了与蛋白酶K检测相关文献，标准参照了GB/T 6379.1-2004《测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）》第1部分 总则与定义和GB/T 6379.2-2004《测量方法与结果的准确度》第2部分 确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法。 3、本标准检验方法参考了GB/T 《蛋白酶》和中的酶活力和酶活力单位的定义检测流程还借鉴了Sigma公司和Merk公司有关蛋白酶K酶活力测定的文件。同时，验证了蛋白酶K活力测定的。 本标准主要包括以下7个部分： 范围； 术语和定义； 技术要求； 试验方法； 校验规则； 标志、包装、运输、贮存； 四、工作过程 根据国家标准制修订有关程序和要求，2015年10月下旬，中国标准化研究院主持召开了《蛋白酶K酶活力及杂质检测方法》国家标准制定研讨会。会上，组成了标准起草工作组，明确了任务要求，安排了工作进度，成立了标准起草工作小组，会议研究讨论了《蛋白酶K》初稿，对起草小组在标准起草过程中的一些思考及难点问题进行了深刻讨论，各单位代表就标准内容及方法选择进行了讨论。 （二）开展相关调研情况 蛋白酶K产品标准属于生物产业领域的标准，是支撑生产方、第三方组织开展产品评价的技术依据。起草工作小组首先针对生产和检测开展了大量的调研工作。从满足实际检测需要出发，开展了国内外相关资料的收集和确认工作，资料的检索和信息的收集过程中，分析比较了大量的国内外文献方法。 （三）标准起草完善过程 在广泛调查研究的基础上，标准起草单位组织相关技术人员对蛋白酶K产品标准项目进行了预研，课题组成员广泛收集了国内外蛋白酶K产品的标准、文献，了解了国内外相关技术动态，并且明确了工作思路和进程安排，分析了通过前期的实验摸索、反复论证，确定了本标准方法设定的重要参数， 五、国内外研究概况 蛋白酶K含有两个Ca2+结合位点，距离酶的活性中心有一定的距离，它们与催化机理并无直接关系，但当用EDTA去除Ca2+之后，催化活性将在6 h之内降低至原来的20%，这是由于