抗缪勒管激素对预测牛超数排卵效果研究初探.doc

抗缪勒管激素对预测牛超数排卵效果研究初探 毕江华冯春涛，余文莉.3 （. 北京安伯胚胎生物技术中心，北京1001；2. 石家庄天泉良种奶牛有限公司，石家庄 050051；. 国家肉牛牦牛产业技术体系石家庄综合试验站，石家庄 050051） 关键词: 牛；抗缪勒管激素；超排效果 抗缪勒管激素(anti-Müllerianhormone, AMH) 是140千道尔顿的糖蛋白激素，属于转化生长因子β家族，只在性腺中表达。最初发现 AMH 是睾丸内的成分，抑制男性胚胎的缪勒管发育[1-2]。Josso和Clemente实验室首次将分离纯化的AMH蛋白称为缪勒氏管抑制物，Josso实验室后来命名AMH[3]。在最初几十年的时间里一直局限于胚胎性发育的主要作用上，近几年，随着基础与临床研究的发展，AMH成为生殖医学领域研究的热点[4,5]。 抗缪勒管激素(AMH)是胎儿睾丸支持细胞和卵巢颗粒细胞表达的一类单糖蛋白[6]，对于卵泡的生长发育有重要的调节作用，表现在抑制始基卵泡的生长募集以及通过降低卵泡的FSH敏感性抑制窦前和小窦状卵泡的生长等方面，它能客观地反映“卵泡池”中可生长卵泡的“规模”与“质量”，对于评价卵巢的储备功能以及预测超排效果有积极意义[7,8]。 AMH是人类卵巢储存卵泡数量最好的一个内分泌标记[9,10]，在鼠上也有类似发现[11]。在正常月经周期的女性中，整个月经周期内血清AMH水平无显著波动，维持较稳定的表达，可作为评价卵巢反应性及卵巢储备能力的周期非依赖性的血清学标记物[12]。目前，血清AMH 蛋白检测已经作为评价卵巢储备功能及卵巢反应性的指标，已经申报了美国专利(2007年7月10日)并且获得批准[13]。 牛的超数排卵和胚胎移植(MOET, Multiple Ovulation and Embryo Transfer)已经商业化运作。其中，超数排卵是胚胎移植中胚胎的主要来源，是牛胚胎移植产业化中的关键技术，全球每年有500 000多枚胚胎生产来自超数排卵[14]。通过缩短超排间隔、增加超排次数、选择性重复超排以获得大量优良胚胎，提高供体牛的利用率一直是人们关注的课题[15]。超数排卵效果主要是牛个体对超排药的反应差异表现，原因就是超排处理时牛卵巢活性的不同。Charle`ne Rico等[16]研究表明发情期的中卵泡和大卵泡数和窦前卵泡及小窦状卵泡数呈正相关，有高数量的小和中卵泡数量牛卵巢对超排反应效率高，血液中AMH的浓度与窦状卵泡数呈正比，血液中AMH的浓度可以预测牛超排效果，从而提高供体利用率。目前国内没有AMH浓度预测牛超数排卵效果的研究报道，我们尝试性的做了一些实验，现报道如下： 1.材料与方法 1.1 材料 1.1.1供体牛：河北天和肉牛养殖有限公司提供的系谱完整、无生殖道疾病、营养状况良好，有正常发情周期的13-18月龄纯种和牛育成牛。 1.1.2试剂： 促卵泡素(FSH)：10mg/瓶，中科院动物所；氯前列烯醇(PG)：0.322mg/支，齐鲁动物保健品公司；阴道栓(CIDR)：美国辉瑞动物保健品公司，1.38mg/支；促排三号：25 ug/支，宁波三生药业；雌二醇(E2)：1 mg/mL，加拿大Macdonald’s Prescriptions LAB。杜氏磷酸缓冲液(PBS)：美国GIBCO公司；胚胎保存液(HOLDING)：美国Bioniche公司。其它常用药品：维生素ADE、酒精、碘酊、新洁尔灭、高锰酸钾、生理盐水、利多卡因、土霉素等，选用国产同类药品中的优质产品。 1.2方法 1.2.1 同期发情及超数排卵：在发情周期的任一天上午8:00--10:00供体牛放置阴道栓(土霉素粉+CIDR)，同时肌注维生素ADE注射液10 mL /头，当日为第0天。第1天上午8:00肌肉注射雌二醇0.5mL /头，第5天到第8天，分别在上午7:00和下午19:00每天两次递减注射FSH(2.0mL×2次，1.5mL×2次， 1.0mL×2次，0.5mL×2次)，第7天上、下午注射FSH的同时肌肉注射PG 2支/头，第8天上午注射FSH的同时撤拴并且用生理盐水冲洗阴道。第9天观察发情，在发情后12h进行第一次配种，同时肌肉注射促排三号1支/头，间隔12 h后进行第二次配种。第16天对供体牛进行冲胚。 1.2.2 重复超数排卵：每头牛进行三次重复超数排卵，每次间隔30天。 1.2.3 冲胚：供体冲胚采用非手术法进行。 1.2.4 采血: 分别采取供体牛血5ml，3000rpm/min，离心15min，30min内提取血清，将血清放置-20℃低温保存（避免反复冻融），以备用。血清 AMH 检测: 采用酶联免疫吸附试验法( ELISA)，由武汉优尔生科技股份有限公司测定AMH浓度，试剂盒由美国Clo