短小芽孢杆菌阿魏酸酯酶的分离纯化及性质研究.docVIP

短小芽孢杆菌阿魏酸酯酶的分离纯化及性质研究 　　摘要：通过硫酸铵沉淀、离子交换层析和疏水层析，对短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）发酵液中的阿魏酸酯酶进行分离纯化，并测定其部分酶学性质。结果表明，阿魏酸酯酶的纯化倍数为5.06，回收率达到14.8%。该酶的相对分子质量约为28.6 ku；最适反应温度为50 ℃，最适pH为5.8，在40～45 ℃和pH 5.8～8.2都能保持很高的稳定性。K+、Co2+、Ca2+和DTT对酶活有明显的促进作用，而Cu2+、乙醇和苯甲基磺酰氟严重抑制了其酶活。以阿魏酸甲酯为底物，测得Km为0.25 mmol/L，Vmax为6.27 U/（min?mg）。 　　关键词：短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）；阿魏酸酯酶；纯化；性质 　　中图分类号：R284.2；R378.7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）10-2611-04 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.10.040 　　Abstract： Extracellular ferulic acid esterase（FAE） from Bacillus pumilus was purified by ammonium sulfate precipitation， ion-exchange chromatography and Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow column. FAE was purified 5.06 fold as shown in SDS， the recovery was 14.8% and the molecular weight estimated to be about 28.6 ku. The optimum temperature for FAE was 50 ℃ and the optimum pH was 5.8 respectively， and activity at temperature of 40 to 45 ℃ and pH 5.8～8.2 was high and stable. The enzymatic activity was activated by K+， Co2+， Ca2+ and DTT， whereas it was completely inhibited by Cu2+， ethanol and phenyl methane sulfonyl fluoride（PMSF）. The Km against methyl ferulate was 0.25 mmol/L and Vmax was 6.27 U/（min?mg）. 　　Key words： Bacillus pumilus； ferulic acid esterase； purification； property 　　阿魏酸酯酶（Ferulie acid esterase，FAE）又称肉桂酸酯酶，属于半纤维素降解酶系，其主要功能是水解阿魏酸与多糖连接的酯键[1]。阿魏酸酯酶的来源广泛，目前发现产FAE主要来源于真菌黑曲霉（Aspergillus niger）、嗜热侧孢霉 （Sporotrichum thermophile）、青霉类（Penicillium）、米曲霉（Aspergillus oryzae）等，还有部分来自细菌和放线菌。不同来源的FAE其理化性质、空间结构和催化机制都有着很大的差异。 　　中国是农业大国，粮食加工业每年都要产生大量副产品（啤酒糟、麦麸、玉米麸），利用阿魏酸酯酶和阿拉伯木聚糖酶联合作用，打断阿魏酸与细胞壁中多糖的交联，可以获得阿魏酸和低聚木糖等重要的功能性食品基料。在饲料工业、造纸工业、药品等方面同样有广泛的应用[2-5]。 　　本研究从短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）发酵液中分离纯化阿魏酸酯酶，并研究其部分酶学性质，旨在为进一步降解农副产品得到阿魏酸等有价值物质提供理论基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　短小芽孢杆菌采用PDA斜面培养基保存；阿魏酸甲酯（MFA）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、反式阿魏酸标准品、牛血清白蛋白（BSA）：Sigma公司。 　　1.2 培养基及培养条件 　　发酵培养基（g/L）：燕麦木聚糖（Xylan）10.0、去淀粉麦麸（DSWB）30.0、胰蛋白胨4.0、酵母粉2.0、K2HPO4 3.0、NaCl 2.0。装液量为300 mL三角瓶75 mL，初始pH 7.0，按5%（V/V）接种量，于45 ℃、200 r/min，培养48 h。 　　1.3 阿魏酸酯酶酶活测定 　　采