褐飞虱R2D2基因的克隆及表达分析.docVIP

褐飞虱R2D2基因的克隆及表达分析 　　摘要：R2D2蛋白广泛分布于各种生物体中，R2D2是siRNA介导的RNA干扰途径中的关键组分。R2D2含有一个串联的dsRNA结合功能域，与Dcr-2在体内形成杂合二聚体，在siRNA装载入RISC时发挥作用。本研究克隆了褐飞虱（Nilaparvata lugens St？?[l）R2D2基因（NLR2D2），结果表明，NLR2D2基因全长 1 673 bp，含有一个长1 005 bp的开放阅读框，编码335个氨基酸。NLR2D2蛋白与蚂蚁亲缘关系最近。利用qRT-PCR检测NLR2D2基因在褐飞虱不同发育阶段的表达，发现NLR2D2转录本在褐飞虱的所有发育阶段都有表达，在1龄若虫中表达量最低，随着生长发育表达量逐渐升高。NLR2D2基因的序列特征和表达谱非常保守，为其功能的分析提供了信息。 　　关键词：褐飞虱（Nilaparvata lugens St？?[l）；R2D2基因；克隆；表达 　　中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）16-4294-04 　　DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.16.057 　　从原虫、真菌到植物，从无脊椎动物到脊椎动物，RNA干扰（RNA Interference，RNAi）广泛存在于生物界中。RNA沉默依赖于21～30个核苷酸长度的小RNA分子，分为3种类型：小干扰RNA（Small interfering RNAs，siRNA）、微小RNA（MicroRNAs，miRNA）及Piwi相关的干扰RNA（Piwi-associated interfering RNAs，piRNAs）。Dicer-2（Dcr-2）、Argonaute-2（AGO2）和双链RNA结合蛋白R2D2是siRNA介导的RNA干扰途径中的3个关键组分。Dicer-2/R2D2复合物不仅产生siRNA，还能结合siRNA（依赖于R2D2的dsRNA结合区域），并促进siRNA与siRISC的结合。在这个过程中R2D2可视为连接RNAi起始阶段和效应阶段的桥梁。Dicer-2、R2D2除了作用于siRNA的产生外，还作用于siRNA的解旋，解旋的siRNA则可作用于启动siRISC[1]。研究发现，果蝇敲除R2D2基因后，FHV的滴度显著上升[2]，对果蝇DXV的感受性也极显著提高（P0.01）[3]。 　　褐飞虱（Nilaparvata lugens St？?[l）属同翅目飞虱科昆虫，又称褐稻虱。褐飞虱是水稻主要害虫之一，在中国长江流域和华南及西南广大稻区发生频繁、危害严重[4]。本研究从褐飞虱体内分离得到R2D2基因，分析了R2D2基因的全长、结构，并对其在发育过程中的表达进行分析，以期为研究其进化提供新的资料，为研究褐飞虱R2D2基因的功能和在RNAi中的作用提供依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 材料 褐飞虱品种（生物型Ⅱ）为武汉大学收藏，饲养在感虫水稻品种台中1号（TN1）植株上，环境条件为（25±2） ℃，80%的相对湿度，光照培养16 h/d，黑暗培养8 h/d。 　　1.1.2 试剂 试验所用大肠杆菌E. coli DH5α、Ex Taq酶、逆转录试剂盒和pMD18-T克隆载体、5′-Full RACE和3′-Full RACE试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。引物合成及序列测定由北京擎科新业生物技术有限公司完成。 　　1.2 方法 　　1.2.1 总RNA的提取 使用总RNA提取试剂盒RNAiso Plus提取褐飞虱发育时期的总RNA，将溶于无核酸酶水中的RNA置于-80 ℃冰箱中备用。 　　1.2.2 cDNA克隆 利用Apis mellifera的RLC蛋白（RISC-loading complex subunit tarbp2-like）（GenBank登录号：552226）在褐飞虱的ESTs数据库（http：//bphest.dna.affrc.go.jp/）中进行TBLASTN查询，找到褐飞虱的EST片段（GenBank登录号：NLHT2093）。以该EST序列为模板设计RACE引物，以提取的总RNA为模板，使用RACE试剂盒分别合成5′和3′RACE cDNA。以合成的cDNA第一链为模板，进行Outer PCR反应和Inner PCR反应，反应引物见表1。Outer PCR反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，20个循环；72 ℃再延伸10 min。Inner PCR反应程序与以上程序相同，只是改为30个循环。PCR产物利用宝生物工程（大连）有限公司试