高效液相―电喷雾串联质谱法测定动物肌肉组织中的糖皮质激素.docVIP

高效液相―电喷雾串联质谱法测定动物肌肉组织中的糖皮质激素 　　摘 要 本实验建立了肌肉组织中氢化可的松、可的松、泼尼松和地塞米松含量的高效液相色谱-电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）检测方法。样品经酶水解、乙酸乙酯提取、HLB固相萃取净化，C8色谱柱分离，在多反应选择性监测模式（MRM）下采用负离子模式进行信号采集和测定。4种糖皮质激素的检出限为0.13～0.25 μg/kg， 定量限为0.25～0.5 μg/kg。在0.5～50.0 μg/L范围内具有良好的线性关系（R20.99）。在0.5， 5.0和10.0 μg/kg基质加标水平下，4种物质的平均回收率为74.0%～101.8%，相对标准偏差0.7%～8.6%。 　　关键词 糖皮质激素； 高效液相-电喷雾串联质谱； 固相萃取； 肌肉组织 　　1 引 言 　　糖皮质激素是一种固醇类激素，在临床上对人体有明显的消炎作用，也可起到免疫抑制和抗过敏作用[1，2]。最早被人们所认知的糖皮质激素有可的松和氢化可的松，属于内源性糖皮质激素，之后又合成了疗效更好的人工糖皮质激素，临床常用的合成糖皮质激素有地塞米松、泼尼松和泼尼松龙等，图1为常见4种糖皮质激素结构图[3～6]。 　　在动物饲养过程中，糖皮质激素还可起到生长促进作用，因此部分饲养者违规使用糖皮质激素类药物[7，8]。不恰当的使用可导致动物源性食品中药物残留，影响食用者健康，如内分泌紊乱和消化系统疾病等[9]。因此，许多国家已经对动物源食品中合成糖皮质激素残留量进行明确、严格的管理和规定。我国农业部在235号公告明确指出地塞米松在猪、牛、马的肌肉和肾脏中不得超过0.75 μg/kg，肝脏中不得高于2 μg/kg，奶中含量不得超过0.3 μg/kg[10]，但没有对可的松和氢化可的松进行限量规定。 　　目前，有许多分析技术应用于检测分析糖皮质激素含量。放射免疫技术具有迅速、灵敏和高通量的特点，但在常规筛查中缺乏选择性[11]。高效液相色谱和气相色谱无法对样品进行定性分析，灵敏度和特异性都无法满足痕量兽药残留分析[12]。气相色谱串联质谱（GC-MS）虽然灵敏度高，选择性和特异性好，但是衍生过程繁琐，不易操作[13]。液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）是分析动物源性食品中痕量兽药残留的重要方法，能够满足对低浓度样品的准确分析[14，15]。 　　由于肌肉样品基质比较复杂，国内对不同肌肉组织中糖皮质激素含量测定的相关报道较少。文献[4]指出部分糖皮质激素可与组织蛋白形成共轭化合物，影响提取效率。因此，提取样品中游离态和结合态的目标物，去除杂质，减少基质干扰是本实验的主要目的。本研究将对不同的肌肉组织进行酶解处理结合态目标物，固相萃取法净化浓缩样品，经LC-MS/MS检测，建立肌肉组织中氢化可的松、可的松、泼尼松和地塞米松4种糖皮质激素含量的检测方法，为肌肉中测定糖皮质激素含量提供参考。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器、试剂与材料 　　液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）联用仪（美国Agilent公司）由Agilent 1200和Agilent 6410三重四级杆串联质谱构成，配有电喷雾离子源（ESI）； 氮气吹干仪（美国Organomation），MilliQ去离子水发生器（美国Millipore公司）； 24位固相萃取装置（美国Supleco公司）； 高速离心机（德国Eppendorf公司）； 恒温振荡培养箱（太仓市强乐实验设备有限公司）。图1 4种糖皮质激素类药物结构图 　　Fig.1 Structural formulas of the investigated glucocorticoids 　　甲醇、甲酸（色谱纯，美国Honeywell公司）； 乙酸乙酯、乙酸铵、（分析纯，国药公司）； 超纯水（电阻率≥18.2 MΩ?cm）； β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶（100000 units/mL， 上海安谱公司）； Oasis HLB固相萃取小柱（500 mg/6 mL，美国Waters公司）。 　　标准品可的松（Cortisone，COR）、氢化可的松（Hydrocortisone，HCOR）、地塞米松（Dexamethasone，DXM）（德国Dr Ehrenstorfer GmbH公司，纯度97%）； 泼尼松（Predisone，PNS，加拿大TRC公司，纯度98%）。 　　2.2 标准品配制 　　分别称取适量标准品，用甲醇配成1 mg/mL的标准贮备液， 20℃避光储存。准确移取上述标准储备液，以初始流动相稀释得到所需标准工作液，4℃储存备用。 　　2.3 样品前处理 　　（1）提取 肌肉组织均质后，准确称取2 g（精确至0.01 g）组织试样于50 mL离心管中