兽医病毒学实习二细胞冷冻与解冻.docVIP

獸醫病毒學實習二:細胞冷凍與解凍 目的: 了解如何將細胞進行冷凍。 了解細胞冷凍時所需的條件與設備。 了解如何調配10%的DMSO。。。 了解細胞冷凍與解凍時的注意事項。 儀器用具與藥品與試劑 37 水浴槽–80 ℃冰櫃冷凍離心機倒立顯微鏡37 ℃培養箱液態氮桶培養角瓶塑膠尖管離心管 離心機 微量分注器(pipette) 酒精燈與打火機 冷凍保存管 漸凍盒 燒杯與冰塊 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)胎牛血清(fetal calf serum, FCS) ，37水浴抗生素(100 U/ml pencillin, 100 (g/ml streptomycin0.25 mg/ml amphotericin) 7.5%碳酸氫鈉(sodium carbonate)PBS(phosphate-buffered saline, pH 7.2)21. Trypsin-EDTA(0.25% trypsin, 1 mM EDTA)22. 維持性培養液(Maintenance medium)-5% FCS2. 成長性培養液(Growth medium)-10% FCS 2. DMSO二甲基亞碸 (抗凍劑) (二)步驟: 細胞冷凍方法步驟： 1. 細胞培養3~4天左右，細胞已佔滿生長平面空間confluence)將培養液吸掉，加入10 ml PBS緩衝液洗細胞表面，再將PBS儘量完全吸掉。 2加入1 ml Trypsin-EDTA（以能覆蓋細胞表面為原則），置入37 細胞培養箱數分鐘，單層細胞會從培養角瓶面脫落。 3加入3 ml培養液沖洗下細胞，在4 下，以4,000 rpm離心1分鐘。 4吸掉上層液，再將細胞懸浮移至內含10 ml培養液的75T型培養角瓶，置於 37 細胞培養箱。 5取一培養角瓶(內含已培養四天之豬腎細胞P-15布滿其生長平面空間和少 許的培養液) 。6. 用酒精將紙巾噴濕,打開培養角瓶，將瓶口與瓶蓋晃過酒精燈火焰，倒出瓶內 培養液。 再次將培養角瓶瓶口與瓶蓋晃過酒精燈火焰，將微量分注器接上塑膠尖管， 並吸取PBS 1ml，注入培養角瓶。再次將培養角瓶瓶口與瓶蓋晃過酒精燈火焰，蓋上瓶蓋，搖晃培養角瓶使PBS清洗細胞表面，然後倒出瓶內的PBS。再次將培養角瓶瓶口與瓶蓋晃過酒精燈火焰,以微量分注器吸取 Trypsin-EDTA 1ml，注入培養角瓶,使細胞熟悉Trypsin-EDTA和等一下 會遇到的環境。輕輕搖晃培養角瓶後，打開培養角瓶，並將瓶蓋與瓶口晃過酒精燈火焰,倒出瓶內的Trypsin-EDTA 1ml。 再次以微量分注器吸取Trypsin-EDTA 1ml注入培養角瓶，並搖晃或是靜置培養角瓶等待在生長平面空間上的P-15細胞全都被Trypsin-EDTA消化並且懸浮於培養液中。 拿好培養角瓶在椅墊上用力拍擊數次，使細胞之間能夠完全分散。打開培養角瓶,瓶口與瓶蓋在酒精燈火焰上晃過，然後將培養角瓶內的液體倒入離心管，然後用微量分注器將1 ml的胎牛血清注入另一離心管。 14將兩離心管分別放置於離心機的相對兩邊，以保持平衡並且容易分辨蓋上內蓋離心2分鐘。配製冷凍保存溶液（使用前配製）：將DMSO加入新鮮培養基中，使其最終濃度為5~10％，混合均勻，置於室溫下待用。 1離心完畢後，以微量分注管吸走離心管內上清液，只留下管內底部所沉澱之細胞。 1將此離心管插入燒杯內的冰塊之間，並利用微量分注管吸取1ml調配好的含10%DMSO的抗凍培養液，緩緩一滴一滴滴入離心管，以避免DMSO放熱過快而殺死細胞。 1利用微量分注管在離心管內反覆沖提(重複吸取和注入的步驟) ，直到離心管 底部不再有細胞凝塊。 確認離心管內無細胞凝塊後，使細胞濃度為1~5 x 106 cells/ml，利用微量分注管將離心管內的含細胞的溶液吸到冷凍保存管中。 將裝有含細胞之溶液的冷凍保存管插到冰塊中。 將冷凍保存管放到漸凍盒中，並蓋上蓋子。 冷凍保存方法 1：冷凍管置於 4、 10~30分鐘 →移至-20、30分鐘 → 移至-80、16～18小時（或隔夜）→移至液氮槽vapor phase長期儲存。 細胞凍方法步驟： 起動水浴槽，使其溫度緩慢加熱至37。帶上手套並用酒精消毒後，等待其乾燥後，用酒精將紙巾噴濕置於桌上。 倒出兩個離心管(一內放溶解的細胞,一為在離心機內平衡用)。 點燃酒精燈,將裝有培養液(medium)的塑膠試管管口處過火後，取1.5 ml至平衡用之離心管內，將其置於紙巾上，先放在一旁。 . 小心並且迅速從內放大量冰塊的保麗龍盒中取出冷凍小管，並迅速移至37水浴槽解凍。確認冷凍小管內完全無冰塊後，將冷凍小管自水浴槽拿出,並用酒精擦