改进的指数线性聚合酶链式反应制备可用于焦磷酸测序反应的单链模板.doc

Tm值差异型不对称扩增方法的建立及其在分子诊断中应用 饶华春1，滕继云1，刁勇王立强杨会勇1*周国华* （华侨大学泉州，362021南京军区南京总医院药理科，南京，210002南京，21000） 摘要：以包含BACK1基因上三个SNPs的DNA片段为研究对象，’端引入错配或加入锁核苷酸locked nucleic acid, LNA）和使用浓度（相差10倍）来增加不对称引物间Tm值，改进扩增，单链产物。Tm difference asymmetric amplification , TDA-PCR）可有效提高，引物设计难度，序列的范围；本文还禽流感病毒H5N1的Haemagglutinin, HA）基因保守序列进行扩增焦磷酸测序检测，得的结果与参考序列一致无信号使焦测序更为简便、效率更高，具有很好的通用性和实用性。 关键词：改进的，单链模板制备，单核苷酸多态性，焦测序，禽流感病毒 如何针对诸如糖尿病、心血管疾病、肿瘤等难治性疾病进行防治是当前医药工作领域面临的迫切而又困难的任务，这些疾病传染病成为造成我国人口死亡的主要因素。目前针对这疾病研究越来越多，新的机制和理论不断被提出，总的认识就是这些疾病均与人类基因相关，可以说分子疾病。因此阐明这类疾病的分子机制成为治疗方案的前提条件。人类疾病相关基因序列的检测与其中焦磷酸测序是当前分子诊断较为常用的手段，一种短片段DNA分析检测的理想平台。 焦磷酸测序是基于DNA合成延伸反应的测序技术[1-2]，不需要电泳和荧光标记，可实时分析测序引物相邻的碱基序列，已在分子诊断中如基因特异位点检测和大规模测序领域得到广泛应用本文焦磷酸测序技术来检测通过优化前后不对称扩增获得的单链DNA样本制备质量。 单链DNA样品的获取是很多分子诊断技术的关键步骤之一[1]，如探针杂交、实时荧光定量-PC R 、适体筛选，单链DNA样品质量直接关系到以上述检测平台为基础的检测与研究结果的分析和。目前单链DNA样品制备主要采用微球捕获法，此方法可获得单一的单链产物，但制备步骤繁琐，易发生交叉污染。一般不对称扩增被认为可以产生大量单链DNA样品，但是很多时候扩增效率并不稳定，Linear-After-The-Exponential (LATE)–PCR）技术对不对称PCR扩增技术进行了改进，将引物及扩增产物Tm计算引入到不对称PCR实验设计中 ，可高效率制备用于焦磷酸测序及其他分子诊断平台的单链寡核苷酸分子，可以说LATE-PCR即一种Tm值差异型不对称扩增PCR。但是LATE-PCR要产生高效产生单链苷酸分子，需Tm值、限制性引物Tm值和扩增产物的Tm值（melting temperature of the limiting primer(TmL), melting temperature of the excess primer(TMX) and melting temperature of double-stranded amplicon(TmA)）满足TmL-TmX≥3-5°C和TmA-TmX≤13-18°C 两个条件；经过分析和实验表明，对于很多富含AT的序列以及较长的目的片段，LATE-PCR的引物设计将变得十分困难。 本文通过分析不对称扩增体系中引物和扩增产物Tm值，进一步研究Tm在不对称扩增中与扩增效率和扩增特异性的关系，通过提高大量引物的Tm值（TmX′），降低限制性引物的Tm值（TmL′），优化引物和设计和扩增程序，期望提高长片段和富含AT碱基等DNA片段单链产生效率，又可有效简化焦磷酸测序等分子诊断方法的操作流程和运行成本的单链DNA模板制备。选择BACK1基因三个乳腺癌相关SNP（SNP1-3）和rs2270517（SNP4）的DNA片段为研究对象，通过对比LATE-PCR和本文所TDA-PCR方法的单链扩增效率和焦磷酸测序的结果，对其单链模板制备效果进行考察；同时采用Tm差异性不对称扩增法制备禽流感HA基因单链模板并进行焦磷酸测序检测，以考察其对实际样品检测以及在不同焦磷酸测序系统中的通用性。 实验部分.1仪器与试剂 EDC-810 基因扩增仪（东胜公司，中国）；PowerPac 1000高压电源（美国BIO-RAD公司）；GenGenius凝胶电泳成像仪（美国Syngene公司）；CUV-紫外透射仪（Bioimage公司，美国）；焦磷酸测序装置由本实验室按文献 自行组装完成，R6335光电倍增管（日本Hamamatsu Photonics K.K.公司）、BPCL微弱发光测量仪（北京中国科学院生物物理研究所），N2000色谱工作站（浙江大学智达信息工程有限公司）；PSQ96焦磷酸测序仪器（Pyrosequencing AB 公司，瑞典）。 Taq DNA 聚合酶、dNTPs（1