专题二基因工程的应用讲述.ppt

ES细胞技术发展历史 1995年，Thomson从恒河猴中分离了猴的ES细胞； 1998年，Thomson从人的囊胚中分离成功人的ES细胞； 2000年，Bongso等建立了人的ES细胞株 …… * 2、DNA同源重组技术 (homologous recombination) 在细胞的减数分裂或有丝分裂过程中，相同或相似DNA序列发生的重新组合。 * DNA同源重组技术 20世纪70年代，在酵母的研究中，首先提出DNA同源重组的概念； 1985年，Smithies等在肿瘤细胞中实现了人工打靶载体和内源b-球蛋白基因的同源重组； 1987年，Smithies和Capecchi在小鼠ES细胞中分别实现了次黄嘌呤磷酸转移酶的同源重组和定位剔除； 1988年，Mansour建立了正负筛选方法，筛选与打靶载体发生同源重组的阳性细胞。 * 3、基因敲除或剔除（knockout） 原理：利用基因打靶技术,通过同源重组将靶基因在细胞或动物个体中的活性完全去除, 制备基因剔除动物 。 过程：首先在体外进行靶基因的缺失突变，即构建携带突变基因的打靶载体，然后将打靶载体导入ES细胞，通过同源重组将基因组中的野生型基因置换下来。 1989年基因敲除小鼠首次报道。 * * * * 4、基因敲入（knockin） 原理：通过同源重组将外源基因定点插入基因组，并获得表达，所制备的转基因动物。 过程：首先构建携带外源基因的打靶载体，然后将打靶载体导入ES细胞，通过同源重组将外源基因整合至ES细胞基因组，制备转基因动物。 * 5、条件(conditional)基因打靶 原理：利用Cre-loxP技术，先通过与打靶载体的同源重组，在基因组中引入loxP位点，再通过Cre介导的DNA重组，在特定组织或特定时相，实现靶基因的修饰或改变。 优点：实现基因剔除的时空控制。 1994年，Gu等利用Cre-loxP技术，首先建立了组织特异性基因剔除小鼠。 * Cre-LoxP技术 A TGTAT G T ACATA C Cre酶(cyclization recombinase)：来源于P1噬菌体，位点特异性的DNA重组酶，介导两个34bp的LoxP位点之间的DNA重组，使LoxP位点间的序列或基因被删除。 LoxP位点：由两个13bp的反向重复序列和8bp的间隔序列组成，其中反向重复序列为Cre酶的结合位点，间隔序列决定LoxP的方向。 5’-ATAACTTCGTATA 3’-TATACGGAGTTAT TATACGGAGTTAT-3’ ATAACTTCGTATA-5’ * * 组织特异性的Cre转基因小鼠举例 启动子 Cre重组酶表达的靶组织或细胞 albumin 肝脏 insulin 胰岛b细胞 adipose protein 2 脂肪细胞 b-lactoglobin 乳腺 keratin 5 皮肤 muscle creatine kinase 骨骼肌 myosin 心脏 protamine-1 精子 CD19 B淋巴细胞 proximal lck T淋巴细胞 Wnt-1 or engrailed-2 神经系统 * 可诱导表达的Cre转基因小鼠举例 启动子 诱导物 Cre表达的靶组织 Mx1 IFN 肝脏、免疫细胞 CMV-tTA tetracycline 广泛表达 CMV-ER tamoxifen 广泛表达 * 6、基因捕获技术（Gene Trapping） 原理：建立一个携带随机插入突变的ES细胞库，筛选基因的显性突变或隐性突变； 乙烷亚硝基脲（N-ethyl-N-nitrosourea，ENU）：化学致突变剂，通过乙烷化反应导致DNA的随机、单碱基突变； 2000年，建立ENU基因捕获方法，进行基因显性突变的大规模筛选。 * 7、转座子介导的基因打靶 * (三) 利用核移植技术制备转基因动物 主要应用于大动物； 一般采用胎儿成纤维细胞，经基因打靶的方式将外源基因定点敲入动物基因组，再经核移植将打靶成功的成纤维细胞的核移植入去核的卵母细胞，发育成个体； 优点：将转基因动物的筛选提前到成纤维细胞的筛选，大大降低了转基因大动物制备的工作量和成本。 * 核 移 植 技 术 1938年，Spemann提出了细胞核的全能性和将分化的细胞核移植到卵母细胞的设想； 1952年，Briggs和King将蛙胚胎细胞核注射导卵内，构建的重组胚胎发育成蝌蚪和蛙； 1962年，Gurdon证实已分化的细胞核可恢复其全能性； 1969年，开始哺乳动物的核移植研究； 该技术源于用微细玻璃管对阿米巴原虫进行的核注射 * 1981年，Illmenser和Hoppe将小鼠胚胎内细胞团的细胞核植入去核的受精卵中，克隆出3只小鼠； 1986年，Willadsen