植物生理学综合实验.ppt.ppt

（3）CAT活力测定： 酶提取方法与SOD相同。 CAT活性测定： 取50ml的三角烧瓶，加入2.5ml酶提取液，再加入2.5ml 0.1 mol.L-1 H2O2 (取30% H2O2溶液 5.68ml, 稀释至1000ml，用标准 0.1 mol.L-1 KMnO4 溶液在酸性条件下进行标定)，同时计时，于30水浴中保温10min，立即加入10% H2SO4 2.5 ml以终止反应。然后用 0.1 mol.L-1 KMnO4 标准溶液（用0.1mol.L-1草酸标定）滴定，以出现粉红色（在30min内不消失）为终点。以煮沸失活的酶液为对照。 CAT活力计算：酶活力以每克鲜重样品1分钟内分解过氧化氢的的毫克数表示。 CAT活性=[（A-B）×Vt×1.7]/(W×t×Vs) 式中A为对照滴定毫升数；B为样品滴定毫升数；Vt为酶液总体积（ml）；1.7为1ml 0.1 mol .L-1KMnO4 溶液相当于1.7mg H2O2；W为样品鲜重（g）；t为反应时间（min）；Vs为反应所用酶液体积（ml）。 （4）氧自由基含量测定： 标准曲线制作：1ml 一系列浓度的NaNO2 （0、5、10、15、20、30、40和50 μmol .L-1 ），分别加1ml 1mmol .L-1盐酸羟胺、1ml 17mmol/L的对氨基苯磺酸溶液和1ml 7mmol .L-1的α–萘胺溶液（以冰醋酸：水=3：1 配制），于25℃中保温20min，然后测定OD530。以[NO2-] 为横坐标，OD530为纵坐标作图。 氧自由基含量测定：取上述酶的提取液0.5ml 加0.5ml 50mmol .L-1磷酸缓冲液（pH 7.8）加入1ml 1mmol .L-1盐酸羟胺，混匀，25℃水浴1小时。继续加入1ml 17mmol.L-1 对氨基苯磺酸和1ml 7mmol .L-1 α－萘胺，混匀，25℃水浴20min。在530nm波长处比色，记录OD530值。根据测得的OD530及NO2—标准曲线，将OD530换算成[NO2—]，然后依照羟胺与O2—的反应式 NH2OH+2O2—+H+ → NO2—+H2O2+H2O 从[NO2—]对[O2—]进行化学计量，即将[NO2—]乘以2，得到[O2—]。用下式计算氧自由基含量： 氧自由基含量（μmol /g FW）=[NO2—]/1000×提取液总体积(ml)/0.5/鲜样重量（g） （5）丙二醛含量测定 MDA提取：称取1g左右的鲜样，剪碎，加入2ml 10%的三氯乙酸（TCA）和少量石英砂研磨成匀浆，再加8ml 10%的TCA进一步研磨，匀浆以4000×g离心10 min，上清夜为提取液。 MDA含量测定：吸取2ml上清液（对照加2ml 蒸馏水），加2 ml 0.6%的硫代巴比妥酸（TBA，用10%TCA配制），混匀， 于沸水浴中反应15min ，迅速冷却后再离心。取上清液在532nm、600nm和450nm波长处测定OD值。 含量计算：已知蔗糖与TBA的反应产物在450nm和532nm波长下的比吸收系数分别为85.40和7.40；MDA与TBA反应产物在450波长下无吸收，其比吸收系数为0，532nm下的比吸收系数为155。根据双组分分光光度计法建立方程组，求解方程得计算公式： C1(mmol/L) = 11.71D450 C2(微mol/L) = 6.45(D532-D600) – 0.56D450 式中C1代表可溶性糖浓度； C2代表MDA浓度。 得到上述结果后再根据取样量和提取液总体积折算出每克鲜样中MDA的含量。 实验目的： 植物在水分胁迫下除去失水被动浓缩外，通过代谢活动提高细胞内溶质浓度、降低水势，也能从外界水分减少的介质中继续吸水，维持一定的膨压，因而使植物能进行正常的代谢活动和生长发育。组织水势的变化主要是由于渗透势的变化。脯氨酸通常是一种积累的调节物质。 渗透调节物质的积累 脯氨酸含量的测定实验方法： 1.标准曲线制作：取2 ml一系列浓度（0、2、4、6、8、10μg.mL-1）的脯氨酸标准液分别加入2 ml 3% 磺基水杨酸、2 ml冰醋酸和4 ml 2.5% 酸性茚三酮溶液（以3：2的冰乙酸和6mol.L-1的磷酸为溶剂进行配制），置沸水浴中显色反应60 min。冷却后加4 ml甲苯萃取红色物质。静置分层后取甲苯相在520nm处测定OD值。以脯氨酸浓度为X，以OD520为Y，绘出标准曲线或计算出脯氨酸浓度与OD520之间的线性回归方程。 2.脯氨酸提取：取鲜样0.5 g 或干样100mg，剪碎，加2 ml 3％ 磺基水杨酸研磨，匀浆到入试管中，用4 ml 3％ 磺基水杨酸洗研钵两次，均到入试管中，置试管于沸水浴中提取10min。冷却后以3000 r/min离心10min。取上清