酶免检测技术原理及影响试题.ppt

抗原抗体反应原理 抗原抗体结合反应是抗原决定簇和抗体分子超变区在化学结构和空间结构上具有互补性，使抗原表位嵌入抗体超变区的槽沟，发生特异性结合，其关系如钥匙和锁。 有四种分子间作用力参与并促使抗原、抗体的结合。 抗原抗体反应原理 氢键结合力 范德华引力 静电引力 疏水作用力 抗原抗体结合力 抗原抗体反应特点及影响因素 抗原抗体反应特点：1、特异性 2、比例性 3、可逆性 抗原抗体反应影响因素： 1、反应物自身因素：抗原 抗体 2、反应环境条件：电解质 酸碱度 温 度 抗原抗体反应影响因素： 1、反应物自身因素： 抗原 理化性状、表位种类、数目 抗体 来源、特异性、亲和性、效价 2、反应环境条件： 电解质 8·5g/LNaCl溶液 酸碱度 pH6--9为宜 温 度 最适温度为37℃ 二、酶免疫技术的分类、特点及原理 1、酶免技术的分类 . 酶免疫技术 酶免疫组化 组织切片或其它标本中抗原的定位 酶免疫测定 液体标本中抗原或 抗体的定性和定量 均相 异相 固相酶免疫测定 液相酶免疫测定 1、酶放大免疫测定技术EMIT 2、克隆酶供体免疫分析CEDIA 分离结合、游离酶标记物，底物测定 检测微量短肽激素、小分子抗原 最广泛，酶联免疫吸附试验 小分子激素、半抗原测定 酶免技术的分类 2、酶免技术特点 抗原抗体反应的特异性 + 酶高效催化反应的专一性 主要试剂: 酶标记的抗体或抗原 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性 3、酶免技术原理及特点 原理： 酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应 酶对底物的显色反应 对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析 特点： 灵敏度高、特异性强、准确性好 酶标记试剂能够较长时间保持稳定 操作简便、对环境没有污染。 易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广的新方法。 二、酶联免疫吸附试验 1、基本原理 . 原理 包被 1 2 反应 加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体 3 洗涤 使结合在固相上 的抗原抗体复合物 与未结合的分离 4 底物显色 定性或定量的分析 三个必要试剂 固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物） 酶反应的底物 . 双抗体夹心法（测抗原） 方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色 应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定 HBsAg、HBeAg、甲胎蛋白、HCG等 . 2、方法类型及反应原理 方法类型及反应原理 双位点一步法（测抗原） 方法：用单克隆抗体做成固相抗体和酶标抗体，待测抗原酶标抗原同时加入，加底物显色 应用：与双抗体夹心法相似，提高了特异性、灵敏度，需注意“钩状效应” 竞争法（测抗原） 方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等） 方法类型及反应原理 . 双抗原夹心法（测抗体） 原理：类似双抗体夹心法 操作步骤：类似 应用：乙型肝炎表面抗体 方法类型及反应原理 方法类型及反应原理 间接法（测抗体） 方法用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。 优点一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体 应用常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定 方法类型及反应原理 竞争法（测抗体） 原理：类似检测抗原的竞争法 应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测 方法类型及反应原理 捕获法（测抗体） 应用：病原体急性感染诊断中的IgM型抗体 甲型肝炎HAV-IgM抗体 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体 四、ELISA法检测注意事项 1、标本 避免溶血、 高脂血、 纤维蛋白凝块 尽量新鲜，避免细菌污染 一般5天内检测的血清可4℃保存，否则低温保存。 2、 试 剂 .试剂盒保存于2-8℃ .使用前应先将检测试剂 盒放置室温平衡15-30 分钟，保证酶等液体的初始反应温度及 活性剂的溶解。 .观察外包装和内组份有无漏液。 3、加 样 A. 加样不可太快； B. 要避免加在孔壁上部； C. 不可溅出； D. 避免产生气泡； E. 尽可能使用