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实验一外周血淋巴细胞的分离 PBMC: peripherial blood mononuclear cell (T cell, B cell and monocyte) 原 理 外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 原 理 实验步骤 1.采血，稀释 （外周血：稀释液=1：2） 2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血 （Ficoll：稀释血=1：2） 实验步骤 3.18℃，1500r/min，离心30min 4. 轻轻吸取PBMC层移入另一试管中 5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min离心5min ，弃上清。 注意事项 每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞 Ficoll应适量，外周血应充分稀释 温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果 在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染 细胞计数 1、准备计数板： 2、制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞悬液 3、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液， 4、计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数 实验步骤 5、计算： 细胞数/毫升=（4大格细胞数之和/4）×104 注意事项 1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液 2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡 3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml 5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液、计数 原理 : antigen + antibody 必需条件: specificity visibility 目的原理 本法是指用酶标记抗体进行抗原抗体反应，从而将抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效催化作用结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色变化判断实验结果，可经酶标测定仪作定量分析，灵敏度可达微微克（pg）水平。 常用于标记的酶有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）和碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AP），它们与抗体结合不影响抗体活性，这些酶具有一定的稳定性，制成酶标抗体可保存较长时间。 酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA），简称酶标法，是根据酶免疫测定原理发展的一种技术。基本的方法有三类，即间接法、双抗夹心法和抗原竞争法。 双抗夹心法 实验步骤 1.?包被：取羊抗鼠IgG包被单抗20ug,用0.01M Tris-HCl稀释至10ml,加入96孔板中,每孔100ul,4℃过夜； 2.?封闭：用洗涤液(含0.01%Tween-20的0.01M PBS)洗涤两次,然后加入封闭液(含15%小牛血清的0.01M PBS),每孔300ul,37℃,孵育2h； 3.加样品：洗涤两次, 加入标准品鼠IgG 1ug/ml, 每孔100ul, 37℃,孵育2h； 4. 加羊抗鼠IgG-Fc-HRP: 洗涤两次,加羊抗鼠IgG-Fc-HRP每孔100ul(5ug/ml),37℃孵育1h； 5. 加底物显色：洗涤两次，加底物OPD反应液每孔100ul，置于室温5－10min； 6. 终止：加终止液2M H2SO4 50ul每孔； 7.检测及绘制标准曲线：于490nm处检测OD值，标准曲线的斜率：b＝ΣXY/ΣX2,标准曲线Y＝b·X (其中，X：浓度（标准品）；Y：比色OD值的均值)。 ８.绘制标准曲线后，通过各孔的OD值在标准曲线上相应位置计算出相应浓度 实验目的 1、熟悉酶联免疫检测手段的原理。 2、掌握双抗夹心ELISA的试验操作。 融合剂 PEG： 亲水性，使细胞表面极性降低，导致脂质双分子层不稳定，引起细胞融合。 分子量：1500-2000 脾细胞与骨髓瘤细胞融合后的细胞类型 未发生融合骨髓瘤细胞及其同核融合体：其DNA合成的主要途径被A阻断后，由于缺乏HGPRT而不能利用培养液中的H，虽TK可利用T，但不能完成完整的DNA合成过程； 未发生融合的脾细胞及其同核融合体：培养液中不能长期生长，7天左右即死亡 脾细胞和骨髓瘤细胞的异核融合