在PCR步骤使用高保真的耐热DNA聚合酶.ppt

(二）利用PCR对基因功能进行 分析和改造 (三） 基因拼接 （四）In vitro evolution of gene- coding protein DNA Shuffle 基本过程 1．Preparation of genes to be shuffled 2．Fragmentation with DNase I 3．Reassembly by thermocycling in the presence of a DNA polymerase 4．Amplification of reassembled products by a conventional PCR 怎样提高高保真的重组体 1．在步骤2）使用Mn2+而不是Mg2+ 2．在PCR步骤使用高保真的耐热DNA聚合酶 PCR Random Mutagenesis 1．提高PCR反应体系中Mn2+的浓度（可到640uM） 2．在保持Mn2+浓度的基础上，升高dGTP浓度可进一步提高突变率 怎样获得理想的突变率 每1000bp含2-6个突变碱基是理想的突变率 1．选择缓冲液 2．突变偏向（mutational bias) 评估方法：1）transition/transversion Transition： 嘌呤突变为嘌