神经生物学实验课细胞培养2课件.pptVIP

原代神经细胞培养 原代培养细胞的生命归宿 原代培养期 传代期 衰退期 贴附生长型细胞 必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难以确定其稳定形态的细胞。见于各种实体瘤细胞 悬浮生长型细胞 不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。见于各种造血系统肿瘤细胞  每代贴附生长细胞的生长过程 游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期） 游离期： 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。 10分钟一4小时 贴壁期： 细胞附着于底物上，游离期 结束。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白先吸附于底物上，悬浮细胞再与底物附着。 进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团） 潜伏期 此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。 对数生长期： 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。 停止期（平台期）： 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性 原代神经细胞培养操作步骤 1. 超净台紫外灯照射消毒，至少30分钟，开恒温水浴箱至37℃ 2. 取出高糖DMEM、FBS、胰蛋白酶复温。 3. 取新生鼠1只，0.5%的碘伏消毒，断头，取整脑于含5ml的DMEM液培养皿中，分离大脑皮质于含1ml DMEM液的另一培养皿（培养皿均置于冰盒上)。 4. 弯头剪刀尽可能剪碎组织。 5. 向剪碎的组织中另加DMEM4ml，全部吸入离心管，加5ml胰蛋白酶。 6. 置37℃水浴中15分钟。 7. 加含10%FBS的DMEM10ml，吸管轻匀吹打，尽量使组织分散。 8. 离心1500rpn，5分钟。 9. 弃上清，加10mlDMEM10%FBS，吸管轻匀吹打，200目滤网过滤，取少量滤液镜下细胞计数。 10. 以105的接种于培养瓶中，标记后置37℃，含5%CO2培养箱培养。 11. 12-24小时后，换液观察。 细胞计数 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。 血细胞计数器：手工计数细胞 Coulter计数仪：人工计数 在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。 用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。 注意事项： 无菌操作原则 培养细胞生长的条件 细胞的营养需要（培养基，血清，添加因子等） 细胞的生存环境 温度: 37 ℃ O2 CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 渗透压 无污染 无毒 细胞传代培养 培养细胞的生长过程 传 代 培 养 当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养。传代培养的累积次数就是细胞的代数，一般细胞的代数为50代。 细胞传代方法 根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。 1 悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3 贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。 贴壁生长细胞传代方法 吸光培养瓶中的培养液。 2. 用无钙镁离子的PBS清洗细胞3遍. 3 . 加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准），静置1-2 min（显微镜下动态监测）。 4. 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。 5. 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。 6. 吸取1/10—1/4