细胞的冻存及复苏范例.ppt

“ ” “ ” 细胞冻存与复苏 细胞的冻存和复苏 1.细胞冻存 细胞冻存与细胞传代保存相比优势在于：一，可以减少人力、经费投入，减少污染，减少细胞生物学特性变化；二，有利于保存那些不立即使用的细胞系或者将细胞系转给其他使用者。 1.细胞冻存 目前，动物细胞一般保存于液氮（-196℃）。 细胞的冻存和复苏 2.细胞复苏 在体外培养工作中，常要将体外培养物进行冷冻保存，在需要时再复温融解进行体外培养（复苏）。 细胞的冻存和复苏 为使细胞复苏时存活率最高 最佳的冻存条件： 尽可能地降低细胞内的晶体形成，减小细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细胞造成的损伤。 A) 缓慢冷冻 B) 用亲水的低温保护剂排除水分 C)在尽可能低的温度保存细胞 D)快速复苏 细胞冻存与复苏的原理 要获得好的冻存与复苏效果，必须了解如下几个问题：冷冻速率、复苏速率、冷冻保护剂，冷冻保存温度。 细胞冻存与复苏的关键因素 冷冻速率：降温的速度，直接关系到冷冻效果，对一种细胞进行冷冻保存之前，首先需要测定其最适冷冻速率，以保证获得最高的冷冻存活率。 细胞冻存与复苏的关键因素 冷冻速率 细胞冻存与复苏的关键因素 不同的冷冻速率使细胞内发生不同的生理变化，也可以产生不同的损伤。冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，超过一定程度时即失去活性。同时引起细胞外溶液部分结冰，未结冰的溶液中溶质浓度增高产生溶质损伤。当冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成冰晶，造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。 冷冻速率 复苏速率：在细胞复苏时温度升高的速度。复温速率不当也会降低冻存细胞存活率。一般来说，复温速度越快越好，速度过慢，细胞内往往重新形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成的细胞损伤非常快，往往在极短的时间内发生。 细胞冻存与复苏的关键因素 复苏速率 冷冻保护剂：可以保护细胞免受冷冻损伤的物质分为渗透性和非渗透性两类。 不同的冷冻保护剂有不同的优、缺点。目前一般多联合使用两种以上冷冻保护剂组成保护液。 冷冻保护剂 细胞冻存与复苏的关键因素 冷冻保存温度：能长期保存细胞的超低温度，在此温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止，但经过长期保存，在复苏后仍能保持正常的结构和功能。 液氮温度（-196℃）是 目前最佳的冷冻保存温度。 保存温度 细胞冻存与复苏的关键因素 冷冻速率：慢冻 复苏速率：快融 冷冻保护剂：渗透性和非渗透性 冷冻保存温度：－196 ℃（液氮） 冷冻保存方法 1．非玻璃化冷冻 非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-70 ℃ ～-80 ℃ ，然后直接投入液氮进行保存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至-1000C以下，再直接投入液氮保存的方法 该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成 冷冻保存方法 2．玻璃化冷冻 玻璃化冻存则是指利用多种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞，直接投入液氮进行冻存的方法。以该种方法冻结的细胞悬液没有冰晶的形成。 玻璃化冻存法对细胞活性的保存具有较好的效果，不需要复杂的仪器设备，具有液氮储存设备即可使用。目前，该方法已在胚胎冷冻方面得到广泛应用，但很少应用于一般细胞的冻存。 细胞复苏方法 1、液氮中取出冷冻管→27~38℃水浴中，约1min融化 2、室温下5min，用25 ℃左右血清培养液稀释至原体积的4倍。 3、500r / min，低速离心10min。 4、去上清液，加新鲜培养液培养。 “ ” “ ”