限制性核酸内切酶范例.ppt

限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶是可以识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。 限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是提高自身的防御能力. 限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNA。 根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。 第一型限制酶 同时具有修饰（modification）及识别切割（restriction）的作用；另有识别（recognize)DNA上特定碱基序列的能力，通常其切割位点（cleavage site）距离识别位点（recognition site）可达数千个碱基之远。例如：EcoB、EcoK。 第二型限制酶 只具有识别切割的作用，修饰作用由其他酶进行。所识别的位置多为短的回文序列（palindrome sequence）；所剪切的碱基序列通常即为所识别的序列。是遗传工程上，实用性较高的限制酶种类。例如：EcoRI、HindⅢ。 第三型限制酶 与第一型限制酶类似，同时具有修饰及识别切割的作用。可识别短的不对称序列，切割位与识别序列约距24-26个碱基对。例如：HinfⅢ。 生理意义 限制作用实际就是限制酶降解外源DNA[1] ，维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受到保护。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。所以，能产生防御病毒侵染的限制酶的细菌，其自身的基因组中可能有该酶识别的序列，只是该识别序列或酶切位点被甲基化了。但并不是说一旦甲基化了，所有限制酶都不能切割。大多数限制酶对DNA甲基化敏感，因此当限制酶目标序列与甲基化位点重叠时，对酶切的影响有3种可能，即不影响、部分影响、完全阻止。对甲基化DNA的切割能力是限制酶内在和不可预测的特性，因此，为有效的切割DNA，必须同时考虑DNA甲基化和限制酶对该类型甲基化的敏感性。另外，大部分商业限制酶如今专门用于切割甲基化DNA。 限制性内切酶的应用 自从I型限制酶发现以来,越来越多地受到生化学家的青睐,因为限制酶对DNA分子具有专一性的切口,而为人们在分子水平上切割分析、重组遗传信息提供了重要的工具。 (一)用于染色体DNA的分析 先将DNA用限制性内切酶切割成一系列片段,利用聚丙烯酷胺或琼脂糖电泳可以轻而易举地将上述片段分离并且通过测定它们在凝胶中的迁移速度或直接在电镜下观察测量它们的大小。这些碎片在整个基因组的排列次序,主要靠几种不同的限制酶部分水解DNA,再对产物进行电泳分析。 用同样的方法也可以进行DNA中各脱氧核普酸的顺序分析。也就是说,逐步使用多种限制酶,可将染色体DNA片段切得很小,如果片段之间出现重迭,分析小的重迭DNA片段的脱氧核普酸的序列,用现在的生化方法是毫无问题的。 (二)确定DNA复制起点或终点的位置在DNA复制开始之后,将DNA分离出来,用限制酶处理,再用电镜观察是在什么地方开始复制的,Fareed等利用EeoRI确定了sV40DNA分子的复制起点。 同理也可以确定RNA在DNA上的转录位置,例如,将标记的RNA与未标记的DNA杂交,就可以知道这段RNA是从哪一段DNA上转录的。 (三)基因的甲基化研究 由于HPal仅能识别切割双链DNA分子中ccGG顺序,但其中Cyt必需是设有甲基化的;而MPsI识别同样的顺序,但其中Cyt必需是被甲基化的。因此有人利用这一对限制酶对真核基因的甲基化程度进行研究(1〕。 (四）应用于DNA重组 分子生物学研究中发现的许多核酸酶类都可用作基因工程的工具。其中能识别特定的回文序列并切割DNA双链的Ⅱ类限制性核酸内切酶在DNA重组技术中被广泛应用。 （五）构建载体 采用5端引入1个限制性内切酶Xcm Ⅰ酶切位点的1对引物,以水稻品种日本晴基凶组DNA作为模板,扩增得到一段627 bp的PCR片段.并将其连接到pGEM-T Easy载体上得到名为T-xia的重组载体.利用限制性内切酶Xcm Ⅰ酶切T-xia载体产生的自制T载体与其他PCR片段连接,检测结果表明,有80%的重组菌能扩增出目的片段。 限制酶的作用位点 质粒 质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。 把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体（Vector）。细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。质粒分子本身是含有