微阵列的应用.ppt

蛋白质/多肽微阵列及其在过敏原分析中的应用 石松传 北京博肽健诺威生物科技有限公司 PART Ⅰ蛋白质/多肽微阵列 protein/pepyide microarray一类生物芯片。是根据蛋白质-蛋白质相互作用规律，将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上而形成的高通量蛋白质检测技术 它是一种高通量的蛋白功能分析技术，可用于蛋白质表达谱分析，研究蛋白质与蛋白质的相互作用，甚至DNA－蛋白质、RNA－蛋白质的相互作用，筛选药物作用的蛋白靶点等。 微阵列示例 蛋白质/多肽微阵列试验流程 蛋白质/多肽微阵列模式分类 微阵列的介质 1.玻璃片 2.醋酸纤维膜、多聚高分子膜、PVDF膜 3.光盘 微阵列的样品 1.纯化蛋白 2.重组蛋白 3.单抗、多抗 4.氨基酸 微阵列生产方法 1.原位合成（in-situ synthesis ）：在载体膜或玻片上连续添加目的氨基酸化学合成短肽。 2.点样法（spotting sample method ）：将合成和纯化好的蛋白质/多肽用特殊的仪器点加到膜载体上，可以分为顺序点样法和并行点样法。重组蛋白、单抗、多抗等靶组件用此方法做成微阵列。 1.表达谱分析： 用于蛋白质谱的研究，能在混合物中很好的区分不同的蛋白质并提供丰富的数据。 2.蛋白质间的相互作用： 在蛋白质微阵列上点有数量巨大的靶组件，可以检测标记蛋白或待研究蛋白的结合活性，一步就可确定结合对象并获得相关定量数据。 3.药物： 寻找新药物、寻找靶位点；确定已有药物的靶位点；优化药物配伍。 4.诊断： 可做成抗原微阵列或抗体微阵列，在病原体诊断、癌症标记物检测、过敏原检测方面广泛快捷的应用。 微阵列的应用 PARTⅡ 原位合成微阵列 原位合成是直接在固体基质上用21种氨基 酸合成所需的蛋白质/多肽片段的技术。 下面介绍以下基于SPOT技术的膜结合多 肽微阵列的原位合成方法。 SPOT -tecnology SPOT (the parallel synthesis of oligpeptide arrays on cellulose supports)是Ronald 等于1990年发明的以膜为载体可以并行合成检测多 种多肽的固相肽合成技术，成为多肽微阵列合成中 重要的方法。 Schematic of SPOT Membranes 膜必须是疏松多空但平坦的，纤维素膜 （cellulose）是其很好的选择，性能优异，易于获得，价格便宜。以下几种是常用的规格： Whatman chr Whatman 50 Whatman 540 其他膜介质还有：多聚高分子膜、醋酸纤维膜、PDF膜。 此外还有的用玻璃板，或CD圆盘。 Membrane Functionalization 纤维膜是多聚糖，表面含有羟基自由基，它们会降低AA的结合，因此需要对其进行修饰： 1.酯化反应：?-alanine 与 DIC等 2.共价结合二胺：二氨基丙烷、烷化的PEG（聚乙二醇）等。 功能化修饰在合成完成后要去除这些修饰基团。 Temporary protection of α-amino 由于化学合成肽段过程需要向反应体系中加入很多化学物质，发生很多化学反应，合成是从C-端开始，氨基必须得到保护。 根据所用N-末端保护试剂的不同可以分为两种合成策略： Temporary protection of Side-chain Activition of free amino group 要使游离的氨基酸添加到肽链上，氨基酸的羧基必须活化。 PART IIIA 微阵列在过敏原抗体谱系分析中的应用 　I型变态反应性疾病是一种常见病,大约有1 /4的人受该 疾病得困扰。治疗与预防I型变态反应性疾病的一项重要前 提是检测致敏原的种类,而目前临床可供检测的过敏原有二三 百种之多,常用的体外检测,方法比如RAST 、EL ISA等,具 有操作步骤繁杂,耗时费力且价格昂贵、所需血清样本量大等 缺点,不适合同时对多种过敏原的检测。 近年来,渐趋成熟的蛋白质芯片技术因其高通量、微型化、 平行性检测等优点，可用于过敏原的筛选、检测。典型的例 子是过敏原特异性IgE检测微阵列的研制。 过敏原微阵列诊断变态反应疾病的流程 过敏原微阵列可以为主要过敏疾病提供过敏谱 系，为治疗提供最佳方案。过敏原微阵列诊断变 态反应疾病的流程： 过敏原特异性IgE检测微阵列 基本思路是集常见的过敏原做成微阵列，将 过敏反应者的血清IgE 与微阵列反应，分析 哪些抗原参与了反应，就可确定哪些人