伪狂犬病毒EP0基因特异性siRNA分子的合成与筛选及对病毒复制的影响范例.ppt

伪狂犬病毒EP0基因特异性siRNA分子的合成与筛选及对病毒复制的影响 汇报提纲 一、课题背景 二、研究内容与技术路线 三、结果与讨论 四、小结与展望 五、研究成果 一、课题背景 伪狂犬病毒(PRV)的潜伏感染问题是当前伪狂犬病防治与根除计划的主要障碍 潜伏感染的机理尚不清楚 二、研究内容与技术路线 三、结果与讨论 （一）伪狂犬病毒EP0基因的原核表达与抗体制备 （二）EP0基因特异性siRNA分子的合成与筛选 （三）EP0基因特异性siRNA分子对伪狂犬病毒复制的影响 （一）伪狂犬病毒EP0基因的原核表达与抗体制备 实现了EP0基因目的蛋白的诱导表达并将其免疫动物获得了相应抗体,ELISA检测效价达到了1：81920 pET-EP0的酶切鉴定 EP0蛋白表达的最佳诱导时间的摸索 用EP0蛋白胶条和包涵体免疫家兔制备抗体 ELISA检测抗体滴度 分析与讨论 确立了诱导后3h即达到最高表达量，之后增大诱导时间反而无助于表达量的提高。 分别尝试了用包涵体直接免疫和将表达菌体的SDS胶目的条带切割后加入生理盐水研磨再免疫家兔两种方法。 该抗体不仅可以用于蛋白质水平检测siRNA分子对PRV病毒EP0基因表达的干扰作用，还可用于检测多种不同来源的样品。 （二）EP0基因特异性siRNA分子的合成与筛选 EP0基因相关siRNA靶序列的分子设计、模板DNA的合成及对应表达载体的构建 构建荧光表达载体pEP0-EGFP 通过荧光显微镜观察,流式细胞仪检测和半定量RT-PCR三条途径筛选最佳的siRNA分子 siRNA靶序列的分子设计、模板DNA的合成及对应表达载体的构建 2002年，Xia et al.发现RNA聚合酶II启动子也能高效表达功能性的siRNA CMV启动子是一种很强的RNA聚合酶II启动子之一，广泛用于驱动真核基因在哺乳动物细胞的高效表达 荧光表达载体的构建 不含终止子 EP0 PCR产物 流式细胞仪对荧光表达量的检测 半定量RT-PCR检测 分析与讨论 设计、合成相应的3个siRNA均能不同程度地抑制EP0基因的表达，抑制效率从高到低依次为EP08、EP12和EP04。 进一步证明用RNA聚合酶II启动子驱动siRNA的表达是可行的 ，且比U6和H1启动子适应的细胞谱更广。 以目标基因EP0和报告基因EGFP的融合表达质粒pEP0-EGFP为工具评估3个siRNA分子对EP0基因表达的影响，具有简单、直观和快速等优点 。 （三）EP0基因特异性siRNA分子对伪狂犬病毒复制的影响 通过细胞病变观察、TCID50测定、半定量RT-PCR检测和Western-blot分析分别从病毒感染力水平，mRNA和蛋白质水平三个方面检测siRNA分子的干扰效果 细胞病变观察 TCID50测定 半定量RT-PCR检测 Western-blot分析 分析与讨论 以筛选的最好的siRNA分子p4.1-EP08首先进行预实验，以确定最佳接毒时间和接毒量。设立三组不同的接毒量5μL、10μL、15μL 来确定最佳接毒量为5μL(TCID50=10-5.8/0.1mL) 。 虽然用TCID50和半定量RT-PCR能得出与pEP0-EGFP荧光表达载体干扰模型的相一致的结论，即p4.1-EP08为最佳干扰分子，但用Western-blot 分析时却有细微的差别。 阴性对照的干扰现象。NK是根据人源和鼠源细胞设计的非干扰分子。 四、小结与展望 实现了EP0基因目的蛋白的诱导表达并将其免疫动物获得了相应抗体。 利用构建的荧光表达载体干扰模型从设计合成的三个siRNA分子中筛选出抑制效果最好的一个，抑制率为53.3％。 四、小结与展望 通过细胞病变观察、TCID50测定,半定量RT-PCR和Western-blot分别从病毒感染力水平, mRNA和蛋白质水平分析siRNA 分子对病毒复制早期基因EP0表达的影响，得到了与干扰模型较为一致的结果。 抗EP0蛋白多克隆抗体和特异性抑制EP0基因表达的siRNA分子的获得，为深入研究EP0基因在体内伪狂犬病毒潜伏感染中的时空表达及其与潜伏感染发生、维持及激活之间的关系奠定了良好的基础。 研究成果 习杨，周锐等. 《特异性抑制伪狂犬病毒EP0基因表达的siRNA分子的合成与筛选》 中国病毒学 （已接收） Xi Y, Zhou R, et al. Inhibition of Pseudorabies virus replication by EP0- specific siRNAs. (in preparation ) 致 谢 首先要感谢指导老师周锐副教授和陈焕春院士对我课题的指导！感谢实验室全体同学对我的支持与帮助！ 本实验由国家自然科学基金提供项目资助，特此感