类泛素蛋白FAT10在肝癌中的表达及生物学作用.docVIP

类泛素蛋白FAT10在肝癌中的表达及生物学作用 　　[摘要]目的 探讨类泛素蛋白FAT10在肝癌细胞中的异常表达和功能活化及其分子机制。方法 将38例肝癌大鼠随机分为空白组、pcDNA3.1-FAT10组、FAT10 siRNA组。采用RT-PCR法检测肝癌及癌旁组织中FAT10 mRNA的表达水平，电穿孔法分别将FAT10 siRNA和重组表达载体pcDNA3.1-FAT10转染人肝癌SMMC-7721后，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡的变化，RT-PCR检测PI3K/Akt通路的变化。结果 FAT10 mRNA在大鼠肝癌组织中的相对表达水平明显高于癌旁组织（P0.05），沉默FAT10后，对细胞周期无明显影响，细胞凋亡率上升，PI3K/Akt信号通路表达下调；促进FAT10表达后，对细胞周期无明显影响，细胞凋亡率显著下降，PI3K/Akt通路表达上调。结论 FAT10可通过上调PI3K/Akt通路表达，减少细胞凋亡，增强肝癌细胞的侵袭能力，FAT10可能成为预防和治疗肝癌的靶点。 　　[关键词]肝癌；FAT10；电转法；PI3K/Akt信号通路；凋亡 　　[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）09（a）-0016-03 　　肝癌因其存活率低，发病率高，已成为众多学者关注的对象[1-3]。类泛素是与泛素具有相似功能的蛋白，在结构上与泛素具有部分相同序列。FAT10是一种新发现的，可以通过共价结合发挥泛素样作用的类泛素蛋白[4-6]。其在多种癌细胞如胃肠癌、肝癌等细胞中得以表达[7-10]。因此，本实验先对肝癌及癌旁组织的FAT10进行检测，后将FAT10 siRNA和重组表达载体pcDNA3.1-FAT10转染肝癌细胞，采用多种方法分别检测细胞周期和细胞凋亡的变化，RT-PCR检测PI3K/Akt通路的变化，旨在为肝癌的治疗提供新的手段。 　　1资料与方法 　　1.1一般资料 　　设计：随机对照动物实验。 　　时间及地点：2014年9月～2015年12月在沈阳医学院实验室完成。 　　材料及来源：SMMC-7721细胞株购于上海誉贸实业有限公司，由本实验室保存。L-DMEM培养基、胎牛血清和混合抗生素购自GIBCO公司，FAT10 siRNA和重组表达载体pcDNA3.1-FAT10均由上海吉玛公司合成，电穿孔仪，TRIzol Reagent购自Invitrogen公司，CCK-8试剂盒购于上海Dojind化学科技有限公司，流式细胞仪购于赛默飞公司，多克隆兔抗体Akt购于Proteintech公司，GAPDH抗体购于Bioworld公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体购自优维宁生物技术公司。 　　1.2 RT-PCR检测FAT10表达 　　38例肝癌大鼠开腹，取少量肝癌及癌旁组织粉碎后，加入含1 mg/ml亚铁离子的PBS多次反复冲洗，用匀浆器打匀，并过100 mm滤膜，备用。吸取2 μl的悬浮细胞液，正反向引物各加入1 μl悬浮细胞液。反应循环条件如下：95℃变性5 min，95℃退火30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，45循环，最终72℃延伸7 min。将PCR产物10 μl于1.2%琼脂糖凝胶电泳30 min，采用凝胶自动成像及分析系统，电泳结果用凝胶图像分析系统分析电泳条带光密度值，计算光密度与GAPDH的光比值。 　　1.3流式细胞术检测细胞周期和凋亡 　　未经任何处理的肝癌细胞为空白组。转染FAT10 siRNA（FAT10 siRNA组）和重组表达载体pcDNA3.1-FAT10（pcDNA3.1-FAT10组）48 h后，收集各组细胞，37℃下，0.25%胰酶消化，1500 r/min，离心10 min，去上清，PBS洗涤3次，重悬细胞浓度为1×106/ml。移液枪取100 μl的细胞于流式管中，缓慢加入70%的乙醇溶液，同时用移液枪移取100 μl的细胞于另一组流式管中，缓慢加AnnexinV-FITC溶液，两组流式管4℃下充分振荡，并静置24 h，1000 r/min离心10 min后，除去细胞固定液，PBS溶液洗涤多次，加入100 μl，200 μg/ml的RNA酶溶液，室温静置1 h，加入50 μg/ml的PI液染色，0.5 h后流式细胞仪测定细胞周期和凋亡。 　　1.4 RT-PCR检测PI3K/Akt信号通路 　　按TRIzol Reagent说明书提取各组细胞总RNA，以总RNA mRNA为模板，反转录合成cDNA，在扩增仪上进行RT-PCR。正反向引物各加入1 μl悬浮细胞液FAT10的上游为：5′-AATACCTGGTGTCGGTCTCA-3′，下游为：5′-TCGAGCTCATCCTAA