东部白松种源相关序列多态性（SRAP）分子鉴定实验-辽宁省林业厅.doc

前 言 本标准依据GB/T 1.1-2009的规则起草 本标准的附录A附录B和附录C为规范性附录，附录D为资料性附录。本标准由 本标准起草单位：林业科学研究院本标注主要起草人：陈 罡，，，魏忠平，叶景丰，马，，，刘菲，孟凡金，田永霞，高英旭，王丹，陈阿梅潘文，范俊。 相关序列多态性（SRAP）分子鉴定方法技术规程 echnical regulations of molecular identification method for different provenances of Pinus strobus with sequence-related amplified polymorphism（SRAP）markers 1 范围 本标准规定了以白松（Pinus strobus L.）新鲜为材料，利用相关序列多态性（sequence-related amplified polymorphismSRAP）法对进行分子鉴定的实验方法。 本标准适用于种源的分子鉴定。 2 原理 通过设计一对引物对基因组DNA进行扩增。正向引物（F-primer）含有17个碱基，对外显子进行特异扩增；反向引物（R-primer）含有18个碱基，对内含子区域、启动子区域进行扩增。因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔区长度不同而产生多态性。最终通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将这些特异的多态性片段分离开来，通过比较待测和对照品DNA指纹谱带数据的差异，来判断待测与对照是否为相同。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 相关序列多态性sequence-related amplified polymorphism; SRAP 利用引物对开放阅读框（open reading frames， ORFs）进行扩增，因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔序列长度不等而产生多态性。 3.2 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction; PCR 在耐热DNA聚合酶作用下，于体外快速大量特异扩增待定DNA序列的方法。 3.3 多态性 primer amplified polymorphism 引物在两个或两个以上不同材料基因组扩增，得到数目不同或长度不同的。4 仪器和设备 4.1 通用实验室仪器设备 4.2 PCR扩增仪 4.3 琼脂糖电泳系统 4.4 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳系统 4.5 凝胶成像系统和照相4.6 超纯水4.7 低温高速冷冻离心机 4.8 超微量紫外/可见分光光度计 4灭菌锅 10 液氮罐 4.11 超低温冰箱 电泳仪（）及配套电泳槽与溶液 另有说明，在分析中使用分析纯试剂。好的溶液经高压灭菌后使用实验中使用的水说明均为无菌水。5.1 0.5 mol/L EDTA-二钠（pH8.0） 将18.61 g 四乙酸二钠（Na2EDTA-2H2O溶于80 mL H2O中，加入（Na2OH调节pH至8.0，定容至100 mL，高灭菌4 ℃保存。 5.2 1/L Tris-HCl（pH8.0） 将24.22 g三羟基甲烷（Tris0 mL水中，HCl）调剂pH用水定容至 mL，高灭菌4 ℃保存。.3 5 mol/L NaCl溶液 将58.44 g氯化钠（NaCl溶于mL水中，定容至mL，高压灭菌4 ℃保存。 CTAB-free缓冲液的成分为250 m/L NaCl、200 mmol/L Tris-HCl（1 mol/L pH8.0）mmol/L EDTA（0.5 /L pH8.0）在 mL水中加入 NaCl，搅动溶解后加入 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）mL 50 mmol/L EDTA（pH8.0）定容至 mL，高灭菌4 ℃保存。.5 4×CTAB提取缓冲液 4×CTAB提取缓冲液成分为%（质量浓度）溴代十六烷基三甲胺（、 mmol/L Tris-HCl（1 mol/L pH8.0）20 mmol/L EDTA（0.5 /L pH8.0）/L NaCl（5 mol/L）。在500 mL去离子水中加入40 g CTAB搅动溶解后加入mL 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）40 mL 0.5 mol/L EDTA（pH8.0）mL 5 mol/L NaCl，定容至 mL，高灭菌4 ℃保存。6 TE（pH8.0） 取1 mol/L Tris-HCl（pH8.0） mL，0.5 mol/L EDTA（pH8.0） mL，用水定容至mL，高压灭菌，4 保存。7 EB（1 mg/mL） 取0.05 g溴化乙锭（EBmL水溶解，用铝箔或黑纸包裹