第八章原生质体系列育种技术.ppt

原生质体系列育种技术 原生质体系列育种技术主要有原生质体融合、 原生质体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。原生质体融合育种是基因重组的一种重要方法。 原生质体融合作为一种新的基因重组手段是1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来的，在1982年进行的第届讨论会仍然是最使人感兴趣的议题之一。 由于它具有一系列的特点，所以目前已为国内外微生物育种学者所广泛研究和应用。 我校自1980年承担原轻工业部下达的AS1.398蛋白酶育种新技术研究课题，在我国率先对工业微生物育种的原生质体系列育种技术进行研究，并取得突破性成果。 杂交频率较高 受结合型或致育型的限制较小 二亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。 有的学者认为原生质体融合是和“性”没有关系的细胞杂交，但目前有关工业微生物中原生质体远缘融合的报道仍然不多见，因此不能断言任何种属间原生质体都可实现融合。 尽管如此，较常规的接合、转化、转导方法的应用范围及其杂交频率都大得很多。 遗传物质传递更为完整 存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可性 四株三缺融合亲株融合机率 原生质体融合育种步骤 1．标记菌株的筛选和稳定性验证。 2．原生质体制备。 3．等量原生质体加聚乙二醇促进融合。 4．涂布于再生培养基，再生出菌落。 5．选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。 6．生产性能筛选。 标记菌种的选择 获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种，筛选出营养缺陷型或／和抗药性菌株。 这里最重要的是标记必须稳定。 采用抗药性菌株除可作标记外，在实验室中还可排除杂菌污染的干扰。 至于遗传标记的数量，若是初步探索性试验，为的是确证融合的成功，可以采用多标记菌种。 有学者指出，每个亲本都各带两种稳定的营养缺陷型标记就可以排除以后实验结果中获得的原养型融合子中出现的是回复突变原养型。所以选择标记无须过多。 若已知融合频率较高，为了减少标记对菌株正常代谢的干扰，也可以采用没有标记或一个标记的菌株作为融合的亲本。 原生质体的制备 在细菌原生质体制备中，有两个术语需有所区别，原生质体 (Protoplast) 系用于描述完全去壁后的革兰氏阳性细菌；原生质球(Spheroplast)系用于描述残留或为部分细胞壁束缚住的革兰氏阴性细菌。 在酵母菌中则有时混用。现一般皆称为原生质体而少用原生质球。 原生质体的制备主要是在等渗压溶液中加入合适的细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状细胞。它保持原细胞的—切活性。 在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶、Zymo1yase或纤维素酶等。据报道，在制备彭贝裂殖酵母原生质体时，若在蜗牛酶液中加入α和β-1,3-葡聚糖酶，原生质体获得率会大大提高，在制备啤酒酵母原生质体时还采用—些称为G1uculase或Helicase的商品酶(即蜗牛酶)。 在等渗与低渗溶液中原生质体的制备结果 单细胞与丝状菌酶处理后原生质体 形成模式 棒杆菌和酵母菌原生质体 原生质体 影响原生质体制备的因素 菌体的前处理：为了使酶作用的效果好一些，可将菌作一些前处理。如细菌加入亚抑制剂量的青霉素，粟酒裂殖酵母用2—脱氧葡萄糖处理，以抑制葡聚糖的重新合成。在细菌及放线菌的培养液中加入1～4％的D—环丝氨酸或甘氨酸等， 酵母属酵母通常将对数增殖期的细胞用EDTA或EDTA和巯基乙醇作前处理。 菌体的培养时间：为了使细胞易于原生质体化，一般选择增殖期的菌体。芽孢杆菌采用对数后期更好。对于放线菌，有建议采用对数增殖期到稳定期之间的转换期的菌体最为适当。 酶浓度：对于不同种属的微生物，不仅对酶的种类要求不同，就是对酶的浓度也有差异。 在制备大肠杆菌原生质体时，溶菌酶浓度要避免低于20μg／m1和高于500μg ／ml。因为这都会减少原生质体的形成率。制备枯草芽孢杆菌原生质体时，多数学者采用100-250μg／ml的溶菌酶浓度， 最佳酶浓度还随不同的生长期的菌体而变化，例如对数期的大肠杆菌以100μg／m1为好，而处于饥饿条件下的就需要250μg／m1。在我们实验条件下，处于对数前期的枯草杆菌较对数后期的更难去壁，所需酶浓度更高。 影响原生质体制备的因素 酶处理温度 以枯草杆菌为对象时，温度在25~40℃范围内，完全去壁的时间随温度上升而缩短。但从易于控制破壁程度及避免原生质体因温度的损伤，我们采用35℃左右的温度。大肠杆菌也与此类似。 酵母则多数采用30℃左右。 在青霉菌中，0.8mo1／L的KCl溶液配制的混合酶以33℃为佳，在41℃时几乎不形成原生质体。 细菌类的酶作用温度比较高些，酵母、霉菌类则偏低些。当遇到很难形成原生质体时，用改变温度的