基因重组技术一、技术原理.PDFVIP

基因重组技术 一、 技术原理 基因重组是指不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，形 成新DNA分子的过程。从广义上讲,任何造成基因型变化的基因交流过程,都叫 做基因重组。而狭义的基因重组仅指涉及DNA分子内断裂- 复合的基因交流。真核生物在减数分裂时,通过非同源染色体的自由组合形成各 种不同的配子,雌雄配子结合产生基因型各不相同的后代,这种重组过程虽然也导 致基因型的变化,但是由于它不涉及DNA分子内的断裂- 复合,因此,不包括在狭义的基因重组的范围之内。 二、基因重组分类 基因重组，包括同源重组、位点特异性重组、转座作用和异常重组四大类。 1同源重组 同源重组(Homologus Recombination)，是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同 源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、Rec F、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11- Rad50等等。同源重组反应通常根据交叉分子或holiday结构（Holiday Juncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holiday 结构的拆分。 2位点特异性重组 在位点特异性重组(site-specific recombination)中 DNA节段的相对位置发生了移动，从而得到不同的结果─D NA序列发生重排。位点特异性重组不依赖于DNA顺序的同源性（虽然亦可有很 短的同源序列），而依赖于能与某些酶相结合的DNA序列的存在。 λ噬菌体编码λ整合酶（integrase）。这个酶能指导噬菌体DNA插入E.coli染 色体中。这种插入作用是通过两个DNA分子的特异位点进行重组，将两个环状 DNA分子变成一个大环。在噬菌体感染的早期即有大量整合酶产生，故几乎所 有被感染的细胞都发生整合作用。这种作用可用体外模型来进行实验。用四种 成份混合起来组成反应系统：纯的整合酶；来自E.coli的一种辅助蛋白，称为整 合作用宿主因子（IHF integration host factor ）；镁离子；和含有噬菌体和细菌DNA发生重组交叉的特异位点（称为at tP和attB att源自attachment ）的DNA片段。 　　 对于这个DNA片段，一个简单的制备方法就是人工构建含attP和attB两者质粒 。当整合反应发生时，即在attP和attB处发生交叉重组，产生两个较小的环状D NA。整合反应由整合酶催化，其步骤是彼此偶联的：四条链同时被切断、交叉 和重新连接起来，其间没有发现任何稳定的中间产物。这种前文提到的拓扑异 构酶Ⅱ的反应很相似，即DNA双链同时被切断，然后磷酸二酯键又重新连接起 来，并不需要ATP供应能量。故整合酶实际上能起拓扑异构酶的作用，可使带 有att位点（或类似序列）的超螺旋松弛。并且和拓扑异构酶一样，整合酶也产 生交错的断裂（staggeredcut ）:有七个核苷酸的单键尾端，形成所谓粘性末端 。 　　 整合酶和IHF在att上都有特定的结合位点，体外实验也证明这两种蛋白质结合 在attDNA的特定位点上。每一次重组过程需要20 －40个整合酶分子及约70个IH F分子。故可能这两种蛋白质不仅是作为酶（发挥催化作用），而且在每次重 组中都要形成某种复合物结构。通过缺失实验，证明attP至少要约250bp长，太 短将使其功能丧失，而attB则较短，包括核心（core ）在内约23bp长即有功能 。长250bp 的整个attP可绕在整合酶分子的周围，类似核小体的结构，其中含有 约8个整合酶的单体，每个的分子量约为40000 。attB和attP中有相同的15bp的 核心序列。整合酶与两个核心都相结合。如果两个核心中有一个的顺序有所改 变，则重组的效率将大为降低。但是如果两个核心序列发生了相同的改变，则 顺序交换仍能进行。可见整合酶不但要求特异的序列，而且要求两个核心序列 有同源性。然而，如果λ前病毒受到诱导（induction），则整合作用将被逆转。 此过程称为切出（excision ）。切出后，细菌和噬菌体DNA恢复至原来完整状 态。前病毒受到诱导时即产生又一种蛋白质，称为切出酶（excisionase ）。切 出酶和整合酶一起催化前病毒DNA两端的杂种att位点之间的重组。这时，整合 酶和切出酶一同紧密结合在细菌前病毒杂种att位点上，显然这样就能促使反应 向