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基因重组技术一、技术原理
基因重组技术
一、 技术原理
基因重组是指不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合,形
成新DNA分子的过程。从广义上讲,任何造成基因型变化的基因交流过程,都叫
做基因重组。而狭义的基因重组仅指涉及DNA分子内断裂-
复合的基因交流。真核生物在减数分裂时,通过非同源染色体的自由组合形成各
种不同的配子,雌雄配子结合产生基因型各不相同的后代,这种重组过程虽然也导
致基因型的变化,但是由于它不涉及DNA分子内的断裂-
复合,因此,不包括在狭义的基因重组的范围之内。
二、基因重组分类
基因重组,包括同源重组、位点特异性重组、转座作用和异常重组四大类。
1同源重组
同源重组(Homologus Recombination),是指发生在姐妹染色单体(sister
chromatin)
之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同
源重组需要一系列的蛋白质催化,如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、Rec
F、RecO、RecR等;以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-
Rad50等等。同源重组反应通常根据交叉分子或holiday结构(Holiday Juncture
Structure)
的形成和拆分分为三个阶段,即前联会体阶段、联会体形成和Holiday
结构的拆分。
2位点特异性重组
在位点特异性重组(site-specific
recombination)中 DNA节段的相对位置发生了移动,从而得到不同的结果─D
NA序列发生重排。位点特异性重组不依赖于DNA顺序的同源性(虽然亦可有很
短的同源序列),而依赖于能与某些酶相结合的DNA序列的存在。
λ噬菌体编码λ整合酶(integrase)。这个酶能指导噬菌体DNA插入E.coli染
色体中。这种插入作用是通过两个DNA分子的特异位点进行重组,将两个环状
DNA分子变成一个大环。在噬菌体感染的早期即有大量整合酶产生,故几乎所
有被感染的细胞都发生整合作用。这种作用可用体外模型来进行实验。用四种
成份混合起来组成反应系统:纯的整合酶;来自E.coli的一种辅助蛋白,称为整
合作用宿主因子(IHF integration host
factor );镁离子;和含有噬菌体和细菌DNA发生重组交叉的特异位点(称为at
tP和attB att源自attachment )的DNA片段。
对于这个DNA片段,一个简单的制备方法就是人工构建含attP和attB两者质粒
。当整合反应发生时,即在attP和attB处发生交叉重组,产生两个较小的环状D
NA。整合反应由整合酶催化,其步骤是彼此偶联的:四条链同时被切断、交叉
和重新连接起来,其间没有发现任何稳定的中间产物。这种前文提到的拓扑异
构酶Ⅱ的反应很相似,即DNA双链同时被切断,然后磷酸二酯键又重新连接起
来,并不需要ATP供应能量。故整合酶实际上能起拓扑异构酶的作用,可使带
有att位点(或类似序列)的超螺旋松弛。并且和拓扑异构酶一样,整合酶也产
生交错的断裂(staggeredcut ):有七个核苷酸的单键尾端,形成所谓粘性末端
。
整合酶和IHF在att上都有特定的结合位点,体外实验也证明这两种蛋白质结合
在attDNA的特定位点上。每一次重组过程需要20 -40个整合酶分子及约70个IH
F分子。故可能这两种蛋白质不仅是作为酶(发挥催化作用),而且在每次重
组中都要形成某种复合物结构。通过缺失实验,证明attP至少要约250bp长,太
短将使其功能丧失,而attB则较短,包括核心(core )在内约23bp长即有功能
。长250bp 的整个attP可绕在整合酶分子的周围,类似核小体的结构,其中含有
约8个整合酶的单体,每个的分子量约为40000 。attB和attP中有相同的15bp的
核心序列。整合酶与两个核心都相结合。如果两个核心中有一个的顺序有所改
变,则重组的效率将大为降低。但是如果两个核心序列发生了相同的改变,则
顺序交换仍能进行。可见整合酶不但要求特异的序列,而且要求两个核心序列
有同源性。然而,如果λ前病毒受到诱导(induction),则整合作用将被逆转。
此过程称为切出(excision )。切出后,细菌和噬菌体DNA恢复至原来完整状
态。前病毒受到诱导时即产生又一种蛋白质,称为切出酶(excisionase )。切
出酶和整合酶一起催化前病毒DNA两端的杂种att位点之间的重组。这时,整合
酶和切出酶一同紧密结合在细菌前病毒杂种att位点上,显然这样就能促使反应
向
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