16S+rRNA基因分析在鸭疫里默氏菌鉴定中的应用.pdfVIP

第六届理事会第二次会议叠教学专业委员会2006年会议论文集 16S rRNA基因分析在鸭疫里默氏菌鉴定中的应用 刘文华l2，苏敬良1※，刘颖l，许秀梅l，金鑫l，昊培福l (1．中国农业大学动物医学院，北京100094；2．莱阳农学院动物科技学院，山东青岛266109) 摘要：本实验对鸭疫里默氏茵(包括6个血清型)、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌进行了 16S rRNA基因片段的扩增和测序，并将测序结果进行了同源性比较和酶切分析．根据16SrRNA的测序结 果及EcoR 1和HaelH酶切片段分析，可将鸭疫里默氏茼与其它临床症状易混淆的细茵感染相区别，因而为 鸭疫里默氏茵与其它细菌的鉴别诊断提供了一种快速、准确的分子生物学方法。 鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestife7．，RA)主要侵害雏鸭，由该菌引起的鸭疫里默氏 菌病(又名鸭传染性浆膜炎)呈世界性分布，本病目前已成为危害我国养鸭业的主要细菌性 传染病。 传统的细菌系统分类的主要依据是表型特征，采取的主要方法是对细菌进行纯培养分 离，然后从形态学、生化反应特征以及免疫学特性加以鉴定。德国的Hinz等0998)¨J利用 常规方法和API微量检验系统对199株RA以及从不同宿主菌分离的相似菌株进行了广泛的 生化试验，但其生化特性不一致，不足以作为RA分类的依据。此外，由该菌引起的鸭疫里 默氏菌病与大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、鼻气管鸟杆菌、考诺尼亚菌【2一“l等引 起的细菌病在临床症状和病理变化上相似，传统方法鉴别费时费力，因此有必要建立一种快 速准确的鉴别诊断方法对上述细菌病加以区分。随着分子生物学的发展，一些分子生物学技 术开始用于微生物的种系发育、系统进化、种群分析和疾病诊断上，尤其是PCR技术的出 现使问题出现了转机，它避开了扩大培养这一步，实现了对目的基因的直接扩增，使许多难 于培养或根本不能培养的微生物也可以被研究。 rRNA 在众多的DNA分析方法中，DNA序列分析可谓微生物鉴定的黄金指标。其中16S 基因序列分析在微生物种群分析方面应用更为广泛。16SrRNA是核糖体小亚基的骨架，其 基因在结构上分为保守区、半保守区和非保守区。保守区序列基本恒定，半保守区和非保守 区序列因不同种、属细菌而异，一般不同属细菌16SrRNA基因同源性为70％--90％，而同 一种内不同株间基因同源性99．5％t51。16S rRNA所含信息量丰富且长度适中(1500bp左 右)，易于测序，因此随着微生物核糖体数据库的日益完善，16SrRNA分类系统已成为细菌 分类和鉴定的一个有力工具。本研究根据真细菌16SrRNA通用引物对实验室分离鉴定的6 个不同血清型的15株RA的16S rRNA基因进行扩增并测序，以期建立一种能够快速鉴定 RA的分子生物学方法。 l材料与方法 1．1供试菌株 1l、RA．T2．112、 RA标准血清l、2型和四个未知血清型菌株，分别命名为RA．T1．1 型为078)：均为本实验室保存；鼠伤寒沙门氏菌(血清型为1，4，12：i：l，2)和禽多杀性 巴氏杆菌(血清型为A：1)：购自中国兽医药品监察所。 1．2细菌的培养 将冻存的RA各血清型菌株接种于含2％小牛血清的TSA琼脂平板上，37℃烛缸培养 18h；大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌接种于麦康凯琼脂；多杀性巴氏杆菌接种于含2％小牛血 清的TSA琼脂平板。后三者皆于37C有氧条件下培养18--一24h，供提取茵体DNA用。 1．3模板的制备 TE缓冲液中(10mMTris．Cl，1mMEDTA， 取上述培养的细菌菌落l～2个悬浮于50wE pH8．0)，95(2，加热10rain，186009离心3rain，取上清作为PCR模板。 1．4引物 由上海生物工程技术服务有限公司合成。16S