土壤洗涤法提高DNA回收率概要.ppt

所有情况下，在PVPP纯化步骤后都有一小部分的DNA丢失(比较 FA与FA*, FC与FC*, EA与EA* ， EC与EC*)。 从沉积物中收回更多的DNA，样品10，利用的是硝酸铵和磷酸铵(图1, 10FA, 10FC,10EA and 10EC)。来自沉积物总DNA含量的回收略低于当化学裂解之前纳入EDTA清洗时的情况(图.1,比较FA* to EA* 和 FC* to EC*)或当CTAB代替醋酸铵时的情况(Fig. 1,比较FA* to FC* and EA* to EC*)。 （2）比较悉尼海港的海洋沉积物总DNA回收 图2 从Sydney Harbour, Nova Scotia收集的沉积物14和21中提取总群落DNA的凝胶电泳图。M: 用HindIII 酶切消化的Lambda DNA（箭头指示23.1 kb片段），E：EDTA清洗，A：乙酸铵,C：CTAB，F：无EDTA的清洗。 应用所有方法，只有污染少的沙质沉积物中能成功回收高分子量单一DNA条带，样品21（图2）。 EDTA清洗有利于完整基因组DNA的回收，只有一小部分剪切DNA分子产生(Fig. 2, compare lanes 21 EA to FA and 21 EC to FC) 。 用CTAB代替醋酸铵处理样品21时，总DNA回收量略有减少(Fig. 2, compare lanes 21 EA to EC and 21 FA to FC) 。 图3.从Sydney Harbour, Nova Scotia收集的沉积物14和21中经清洗程序修饰之后提取总群落DNA的凝胶电泳图。清洗液1重复两次（无+号）或清洗液1和3两者同时重复两次（+）。 M: 用HindIII 酶切消化的Lambda DNA（箭头指示23.1 kb片段），E：EDTA清洗，A：乙酸铵,C：CTAB。 在污染较严重的粉质底泥中，样品14，只有当化学裂解前纳入EDTA清洗时才能回收高分子量单一DNA条带（图3）。 当二次加入清洗液1时，才能从这个样品中获得完整的总DNA (Fig. 3, lanes 14 EA and EC) 。当除了二次加入清洗液1，二次加入清洗液3也可以(Fig.3, lanes 14 EA+ and EC+) 。 然而，将样品21用清洗液1和清洗液3分别进行第三次清洗后，总DNA回收量明显降低(Fig. 3, compare lanes 21 EA to EA+ and 21 EC to EC+) 。 当在化学裂解步骤中用CTAB法代替醋酸铵法，来自沉积物DNA的回收量也减少(Fig. 3, compare lanes 14 EA to EC; 14 EA+ to EC+; 21 EA to EC and 21 EA+ to EC+) 。 2、16S rDNA序列的PCR扩增结果 （1）比较从Ste. Croix淡水沉积物的16S rDNA序列的PCR扩增 图.4. 从Ste. Croix 收集的沉积物8 和10提取总群落DNA经PCR扩增聚集的16S rDNA凝胶电泳图。纯（0），稀释10倍（-1）和100倍（-2）的DNA提取物作为PCR的模板。M: 100-bp的DNA片段，E：EDTA清洗，A：乙酸铵,C：CTAB，F：无EDTA的清洗。 阴性对照用“-” 表示。箭头指示的是500 bp分子量片段，星表示扩增的16S rDNA片段。 各种方法回收的群落总DNA的纯度是通过16S rDNA的扩增评估的。 总DNA稀释系列（纯，10-1和10- 2）用于测试沉积物样品中抑制剂的残余量。忽略提取程序，用纯DNA成功地扩增出16S rDNA（图4）。类似的扩增图谱只有从仅油污染的样本8中获得 (Fig. 4, compare lanes 8 FC to EC and lanes FA to EA) 。 EDTA清洗，当与CTAB结合时，可能轻微有助于来自沉积物样本高品质DNA的回收[Fig. 4, compare lanes8(0) EC to FC，EC and EA and lanes 10(0) EC to FC，EC and EA] 。 然而，从受过油污染和利用的沉积物，样品10，用化学裂解法和醋酸铵获得可比扩增产物（图4 泳道10(0)EC 与FA所示）。 （2）比较来自悉尼港海底沉积物的16S rDNA的PCR扩增 图.5. 从Sydney Harbour, Nova Scotia收集的沉积物14和21提取总群落DNA经PCR扩增聚集的16S rDNA凝胶电泳。清洗液1重复两次（无+号,