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b. 替换型载体（substitution vectors) 两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于?DNA的非必须区两端。 用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切成的外源DNA片断置换。 可置换区 MCS MCS 如： ? EMBL4、Charon40等。 ? EMBL4 ? EMBL4的可置换片断内部还有Sal I酶切位点。 以便于进一步消化中间片断，防止自我连接。 左臂 可置换区 右臂 EcoR I BamH I Sal I Sal I BamH I EcoR I Sal I Sal I ?EMBL4 比一般的质粒载体的容量大的多。 用在真核生物基因组文库的建立。 Sau3A BamHI (4)?DNA载体的优点 1978年J. Collins和B. Hohn等人发展出cosmid vector（cos site-carrying plasmid)。指含有抗性基因、单一克隆位点及? DNA cos位点的细菌质粒。 ? DNA： 4—6kb （1）大小 （2）组成 cos序列和控制包装的的序列。 pBR322： 质粒的复制子 抗药性基因 几个限制性酶的单一位点 黏性质粒载体或柯斯质粒载体 pHC79 ①具有?噬菌体的特性： （3）cosmid vector的特点 克隆外源DNA后可以体外包装成噬菌体颗粒。 在寄主细胞内形成环化DNA（但不能形成新的噬菌体颗粒而溶菌 ）。 ②具有质粒载体的特性： 大多带有pMB1或ColE1的复制子，能像质粒一样复制。 有抗生素抗性基因，和插入失活的克隆位点。 ③方便的选择： ④高容量的克隆能力： 45kb （最少不能低于30kb）。 51kb-5kb=45kb 表达型质粒载体 主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。 如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻译信号控制之下。 注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。 复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS 2）大肠杆菌操纵子元件 阻遏基因 I 操纵基因O 启动基因P 核糖体结合位点序列（SD） 转录终止信号区。 1）普通载体元件 表达载体的结构 表达载体将外源基因在宿主细胞中表达成蛋白质，其必要条件是： ⑴ 需要很强的启动子，并能被宿主细胞的RNA聚合酶识别并启动转录 ⑵ 需要很强的终止子 ⑶ 目的基因的编码区必须具有翻译起始密码子ATG，原核表达载体还需要SD序列。 ① 复制起点 pBR322的 ori 但其上失去了克隆位点。 ② Ampr 基因 （1）元件来源 ③ lacZ的启动子 大肠杆菌 ④ lacZ’基因 大肠杆菌lacZ的?-肽链序列， 是LacZ 的氨基端片断。 pBR322的Ampr基因 （2）长度 约2.7kb （3）克隆位点 10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的5’端。 pUC18/19 Ampicillin 抗性和 lacZ的?肽互补（蓝白斑）相结合。 （4）选择标记 蓝白斑选择原理： ① Xgal （5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-?-D-galactoside） ?-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。 Xgal 半乳糖 5-溴-4-氯靛蓝 ?-半乳糖苷酶 ② ?-半乳糖苷酶Xgal显色反应： ③ lacZ的?肽互补 1）?-肽（ lacZ’ ）： ?-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。 lacZ只有在4聚体的状态下才有功能. C端大部分 N端的11-41aa C端大部分 N端的11-41aa C端大部分 N端的11-41aa C端大部分 N端的11-41aa 4聚体 2）受体菌lacZ突变（lacZ?M15） 受体菌基因组的?-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失?肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xgal 受体菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a pUC质粒载体上的lacZ’ 编码?肽与这个缺失突变的?-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。又能分解Xgal。产生蓝色物质。 C端大部分 N端的11-41aa pUC lacZ’ 受体菌lacZ? 3）载体lacZ’与?互补 4）?互补的插入失活 pUC载体上LacZ’的5’端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成。不能互补。 lacZ’ 5’ 3’ ?肽移码突变 lacZ’ 5’ 3’ ?肽 不互补 互补 MCS 外源DNA ④ IPTG的诱导作用 IPT