现代生物技术5.酶工程.pptVIP

* /eng/labfoto/keylab/page_03.htm * * * /.../brett_triple.htm * * * * * * 4、交联法 戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反应，形成席夫（Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。 交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不便。为此，可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短。 常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。 5.4 固定化酶的特性： 将酶或含酶菌体固定化制成固定化酶或固定化菌体以后，由于受到载体等的影响，酶的特性可能会有些变化。 固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。 固定化酶的最适作用温度一般与游离酶相差不大，活化能也变化不大。 酶经过固定化后，其作用的最适pH值往往会发生一些变化。这一点在使用固定化酶时，必须引起注意。影响固定化酶最适pH值的因素主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的性质。 固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子量的大小有一定关系。固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。 5.4.4 固定化酶的指标 相对酶活力 酶的活力回收率 固定化酶的半衰期 1. 固定化酶的比活力：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位或单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。 2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。 连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2） 3. 4. 或称偶联效率，活力保留百分数。 5. 相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化 酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力 高果糖浆的生产 世界上生产规模最大的一种固定化酶。将培养好的含葡萄糖异构酶的放线菌细胞用60～65℃热处理15min，该酶就固定在菌体上，制成固定化酶，催化葡萄糖异构化生成果糖，用于连续生产果葡糖浆。 5.5 固定化酶的应用 消血栓： 纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫反应，无法长期使用。酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。 用包埋法制备的酶固定化技术可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能自由进出。 酶传感器 利用酶的催化作用，在常温常压下将糖类、醇类、有机酸、氨基酸等生物分子氧化或分解，然后通过换能器将反应过程中化学物质的变化转变为电信号记录下来，进而推导出相应的生物分子的浓度。 5.6.2 生物传感器的分类 如：葡萄糖氧化酶电极 水质监测 生物化学需氧量(BOD)定义为：在规定的条件下，微生物分解存在水中的某些可氧化物质，特别是有机物所进行的生物化学过程所消耗的溶解氧量。该过程进行的时间很长，如在20℃培养条件下，全过程需100天，根据目前国际统一规定，在20±1℃的温度下，培养五天后测出的结果，称为五日生化需氧量，记为BOD5，其单位用质量浓度mg/L表示。 酶传感器的应用 环境废水BOD分析仪 葡萄糖传感器和血糖测定仪 ：用葡萄糖氧化酶（glucose oxidase, GOD）制成葡萄糖传感器，可测定血液中葡萄糖浓度。 医疗方面 在日本、加拿大等国广泛用于鱼类鲜度的测定。鱼死后体内ATP经酶解依次形成ADP、AMP、IMP、肌苷、次黄嘌呤和尿酸。鲜度可用K值表示： K=肌苷+次黄嘌呤/ ATP +ADP+AMP+IMP +肌苷+次黄嘌呤+尿酸 食品鲜度 鱼鲜度传感器 大多数鱼死亡后5～20h，ATP，ADP和AMP已分解尽，超过24h，鲜度主要取决于IMP--肌苷次黄嘌呤尿酸。 将这3个步骤的3种酶（5’-核苷酸酶、核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶）固定在氧电极上，制成鱼鲜度测定仪。 K＜20时，鱼极新鲜，可供生食。 20≤K ≤ 40之间为新鲜，必须熟食。 K＞40，不新鲜，不宜食用，这与嗅觉检验结果相一致。 肉鲜度传感器 肉类在腐败过程中会产生各种胺类，故胺类测定能反映肉类的新鲜程度。 用腐胺氧化酶与过氧化氢电极构成多胺生物传感器，或用单胺氧化酶膜和氧电极组成的酶传感器测定肉在贮藏过程中的鲜度。 * * * * * * * * /develop.html 高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性