现代生物技术2.4 基因工程的基本技术.pptVIP

酵母 0.1mol/L LiCl处理 插入外源基因的酵母载体 感受态 40% PEG 4000 利用Li+盐进行转化 对酵母菌转化常用醋酸锂方法。 2.4.3.9 转化酵母菌 2.4.4 植物细胞转化技术 农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒 Ti（Tumor-inducing）介导的。 Ti质粒的T-DNA区可携带任何外源DNA整合到植物基因组中。 载体转化具体方法： 2.4.4.1 重组DNA载体转化法 叶盘转化法 创伤植株感染法 原生质体共培养法 叶盘 消毒 切取 土壤农杆菌 浸泡 看护培养基 愈伤组织 分化幼苗 叶盘法（leaf disk) 植物细胞 原生质体 纤维素酶和果胶酶 DNA 混合入电击缓冲液 1-2kV电击 愈伤组织 幼苗 分化 1. 电击法（electroporation) 2.4.4.2 植物细胞外壁基因的直接转化法 又称高速微型子弹射击法（High-velocity microprojectiles)，利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时能进入细胞的现象，将包在金属颗粒表面的外源DNA分子随之带入细胞内。 DNA 1.2?m钨弹头 吸附 特制手枪 射击植物细胞 装入 2.基因枪法（gene gun） CaCl2、PEG 3.激光微束穿孔转化法 直径小、能量高的激光束可引起细胞膜可逆性穿孔。先在荧光显微镜下找出合适的细胞，用激光源代替荧光，发生激光束脉冲造成膜穿孔，使周围DNA进入细胞。 4.细菌圆球体融合法 细菌圆球体是指去除了细胞壁的细菌细胞。细菌圆球体与脂质体类似，可以通过与原生质体融合及吞噬作用，将外源遗传物质引入植物细胞。 5.多聚物介导法 多聚物如PEG、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸和二价阳离子（Mg2+、Ca2+）与DNA混合，可在原生质体表面形成沉淀颗粒，同时引起膜表面电荷的紊乱，干扰细胞间识别，使原生质体内吞噬外源DNA. 将外源DNA涂在授粉的枝头上，使其沿着花粉管经过珠心进入尚未形成正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中，从而实现基因的转移。这一方法是我国科学家周光宇首先提出设计的，目前已应用于水稻、小麦、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物的转基因研究。 6.花粉管通道法 2.4.5 重组体的筛选与外源基因的鉴定 2.4.5.1 重组体的筛选 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子。 转化子 重组子 期望重组子 为了淘汰未转化的细胞，人们试验了各种不同的基因作为转化的报告基因，包括一些显性的选择标记基因，以及可用特定方法检测其蛋白质产物的基因。 在构建目的基因时将一种报告基因构建在一起，当目的基因转化受体细胞时，报告基因一同被转入。 这种报告基因是受体细胞本身基因组不存在的，而且具有易于检验的表型。 1、报告基因的检测法 2.4.5.2 重组体的鉴定 （1） GUS基因 即β-葡萄糖苷酶基因。 该基因编码的酶很稳定，而且在一般植物中都没有这种酶。该基因的产物经降解后变成两种或多种具有某种特殊性质的物质。 使用不同的酶反应底物，这个基因的表达产物可以分别用分光光度计法、荧光分析法和组织化学元素法等多种方法来检测，反应灵敏度高。 GUS基因是目前植物基因工程中使用最多的报告基因。 （2） NPTII基因 即新霉素磷酸转移酶基因。 （3） CAT基因 即氯霉素乙酰转移酶基因。 （4） NOS基因 即胭脂碱合成酶基因。农杆菌Ti质粒上的基因。 GFP基因即绿色荧光蛋白基因，是从水母中分离得到的一种报告基因。这种基因的产物经一定波长的紫外光照射后，可以激发出绿色荧光。 （5） LUC基因和GFP基因 LUC基因是荧光素酶的基因，荧光素酶能够引起萤火虫在夜晚发光。 2. 转基因生物的PCR鉴定 （1）原理 PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。 （2）过程 1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 3）电泳PCR产物。 4）检查是否有PCR产物。 5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。 (1)探针的制备 3、目的基因分子杂交检测方法 基因探针是一段与目的基因互补的核酸序列，可以是DNA，也可以是RNA，用它与待测样品DNA或RNA进行核酸分子杂交，可以判断两者的同源程度。 作为基因探针，必须是单链并