实验5血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳定量测定一、目的与要求了解.ppt

* * 实 验 5 血清蛋白质醋酸纤维素薄膜 电泳定量测定 一、目的与要求 了解血清蛋白质电泳分离的原理、方法及临床意义。 二、原理 蛋白质是两性电解质，可带正电荷也可带负电荷。带电荷的蛋白质分子在电场中向相反的电极移动，称为电泳。血清中各种蛋白质在PH 8.6的缓冲液中都带负电荷，在电场中向正极移动。移动的速度主要决定于带电荷的多少和分子的大小。电荷多、分子小，移动就快；反之就慢。因此，利用电泳时各种蛋白质分子移动的速度不同，可将血清蛋白质分成白蛋白、α1、α2、β、γ球蛋白等几条区带。 本法是把血清放在用PH 8.6的缓冲液浸透的醋酸纤维素膜上，将此膜条放进电泳槽，膜条的两端通过纱布桥或滤纸桥分别与电泳槽内PH 8.6的缓冲液相连接。通电后，血清蛋白质在此PH环境中以不同速度向阳极移动，泳动到一定时间，取出膜条进行染色，呈现各蛋白色带。如将膜条上区带分别洗下，用分光光度计比色，就能得出各类蛋白质在血清中的含量。 人类血清蛋白的PI和分子量 PI and relative molecular mass of the human serum proteins Protein PI relative molecular mass Albumin 4.88 69 000 α1- globulin 5.60 200 000 α2- globulin 5.60 300 000 β- globulin 5.12 90 000~150 000 γ- globulin 6.35~7.30 158 000~300 000 A ? ? albumin ?1- ?2- ?- ?-globulin 正常人血清蛋白醋酸纤维素膜电泳图谱 点样线 阴极 阳极 三、方法 （一）点样：约2~3μl ——成功的关键！ （二）通电：电压110~130v，电流为 0.4~0.6mA/cm宽，通电45~60min。 （三）染色：氨基黑10B， 3~5min。 （四）漂洗：3~4次，至薄膜底色洗净为止。 （五）定量：取试管6支，编号，将电泳薄膜按蛋白质区带剪开，分别置于试管中。另于空白部位剪一与白蛋白面积相同的薄膜条放入空白管中。向白蛋白管和空白管中加入0.4mol/L NaOH 4ml，其余各管2ml，需反复振摇使其充分洗脱。30min后，用分光光度计进行比色，波长650nm，以空白管作对照，读取白蛋白及α1、α2、β、γ球蛋白各管的光密度。 四、结果与计算 Tube number album α1、 α2、 β γ-globulin Total Absorbance （1）T=2×A album+ Aα1+ Aα2+ Aβ+ Aγ （2）计算每一电泳条带的百分含量 白蛋白% 2×ODalbum = T α1-% = ODα1 T α2-% = ODα2 T β-% = ODβ T γ-% = ODγ T 五、正常值 A：0.60~0.74, α1: 0.02~0.04, α2: 0.04~0.09, β: 0.06~0.11, γ: 0.10~0.19 六、临床意义：作为临床诊断的参考 *