关于ELISA检测过程中遇到问题的探讨.ppt

关于ELISA检测过程中 遇到问题的探讨 河南省兽药饲料监察所 刘金娥 酶联免疫试剂盒检测方法原理 酶联试剂盒检测过程中遇到的问题 目 录 酶联免疫试剂盒检测方法原理 目前 看是操作简单的酶联试剂盒检测工作，想要完成好，也是有难度的：在酶联试剂盒检测过程中会出现很多异常现象，现将可能出现的异常现象及解决方案总结如下： 试剂盒检测过程会出现的问题及解决方案 1、显色淡，灵敏度偏低 2、重复性差 3、出现白板或吸光度值很低 4、全部都显深色 5、出现花板（线性不好） 6、样品的高背景干扰或假阳性 一、显色淡，灵敏度偏低 1、加试剂没有悬空加入造成污染 加液时最好悬空垂直加入（高出板孔面0.5cm） 2、试剂盒、样品使用前未能平衡 使用前试剂盒、样品置室温（20-25℃）平衡90分钟左右 3、检测过程温度未控制在20-25℃ 孵育反应和显色期间控制好温度 4、移液器吸量不足，吸头内壁挂液太多或本身吸头不清洁 校正移液器，用高品质吸头，吸头要配套，每次装吸头要牢固，排 放应完全，吸头一次性使用 5、孵育反应时间不足 准确计时 6、洗涤时冲击力太大，洗涤液浸泡时间太长。 减少洗涤冲击力，最好使用洗板机 按说明书要求的浸泡时 间，准确记住洗涤次数 7、 试剂滴加量不足或顺序颠倒 加显色液时，注意加入量的准确性（关键） 8、显色剂反应时间不足 显色反应时间：严格根据试剂盒说明书要求 ? 9、蒸馏水水质有问题 使用去离子水（双蒸水），检查水的PH值、电导率等 10、样品含酶制剂、重金属、NaN3（叠氮化钠）防腐剂等，抑制酶的反应 样品要经过净化：液液萃取、过净化柱等 二、重复性差 1、加试剂没有悬空加入造成污染 加液时最好悬空加入（高出板孔0.5cm） 2、样品体积多少不一，两次加样间隔时间大 重复某一样品尽可能与第一次加样接近 3、样本加入后未混匀 加完样后要轻轻振荡并在桌上做圆周运动以混匀 4、测量波长设置不对 按说明书正确设置波长 5、酶标仪重复性差 校对酶标仪 6、操作过程中个别孔液体外溅 稳拿稳放，防止外溅 7、不同批号试剂盒中组分混淆 不同批号试剂不能混用 8、瓶盖相互交叉使用 不同组分的瓶盖不能混用（特别是标准品的使用过程中尤其要 注意这一点） 9、洗涤不正确 尽量用洗板机洗涤，手洗时应尽量避免交叉污染 10、孵育条件不一致 相同条件下孵育 11、其它杂物掉入孔内、不慎多加或少加试剂 记 应剔除此孔结果 12、操作人员不一致 最好是一人操作或熟练人员操作 13、 加样量不一致 尽可能使用同一移液器和装紧吸头（选质量较好的吸头，有些 不好的吸头液体挂壁严重） 14、 加试剂前未混匀 加试剂前请混匀试剂 三、出现白板或吸光度值很低 1、终止液当显色剂使用，终止液误作洗涤液稀释 每次配置时均应看清标签标明物质 2、蒸馏水有问题 换