重庆永川区卫星湖水库水体细菌多样性调查.doc

重庆永川区卫星湖水库水体细菌多样性调查 （第二小组 廖敏鹏 刘兴 魏淑婷） 1.卫星湖水库自然环境情况的介绍 重庆市永川区属于亚热带季风性湿润气候，平均气温18.2 ℃，最高气温39 ℃，最低气温2 ℃。年平均降雨量1042.2 mm，平均日照1298.5 h，年平均无霜期317 d。卫星湖全长8公里，水面1500亩，最大水深15 m，库容999×104m3湖湾交错，有自然形成的多个半岛和全岛。湖西北岸为全国农业旅游示范区、省级森林公园黄瓜山和著名的比子沟风景区，湖东南岸为金三维生态花卉园区。在2000年卫星湖永川区政府列为永川市民的饮用水源之一，因此明确卫星湖水库中细菌的多样性就显得尤为重要。 2.材料 2.1 实验试剂 提取缓冲液：200mM NaPO4,?120mM异硫氰酸胍，2%PVP-k30. 150mM,?2%SDS,?0.5MTris 腐植酸去除剂：100mM?十二水硫酸铝铵 DNA结合液：4.5M 异硫氰酸胍 ，0.5M 醋酸钾 (pH 5.2)，溴酚红少许 膜洗涤液：50 mM Tris-cl，0.1mM EDTA，pH 8.0 70-80% 乙醇 洗脱液：2.5mM Tris-HCl(pH8.5)或超纯水（无DNA酶）? pH8.0 5×TBE（5倍体积的TBE贮存液） 配1000ml 5×TBE： Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5mol/l EDTA 20ml（pH 8.0） 凝胶加样缓冲液（6×） 溴酚蓝 0.25% 蔗糖 40% 琼脂糖 溴化乙锭溶液（EB） 0.5μg/ml Taq DNA聚合酶，10×PCR buffer,25mmol/lMgcl2,0.225mmol/ldNTP, 10umol/l引物，模板DNA分子（0.1-2ug/ul） DNA结合液：6M NaClO4 (pH 5.2) ，0.03M NaAC (pH 5.2) 溴酚红少许 膜洗涤液：50 mM Tris-cl，0.1 mM EDTA，pH 8.0 70-80% 乙醇 洗脱液：2.5mM Tris-HCl(pH8.5)或超纯水（无DNA酶）? pH8.0 尿素、去离子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、琼脂糖 PCR扩增相关试剂 2.2 实验器材 5ml离心管，1.5ml离心管，枪头，硅胶膜纯化柱。1.6um、0.22um 滤膜，真空学校对岸，1升，记录位置温度周围水体再 取下过滤装置漏斗部分，使用两只灭菌镊子从边缘夹起滤膜，滤膜上面朝内卷成圆筒状。放入5ml离心管中-20℃保存备用。 3.1.2微生物基因组DNA提取 ⑴.在5ml样品管中加入1 ml提取缓冲液。 注意：提取缓冲液使用前必须先预热溶解沉淀并趁热使用。若样品中含有难裂解微生物，可额外56℃水浴10min。 【去垢剂可破坏细胞壁，去除非DNA的有机、无机成分】 ⑵.把5ml离心管放入涡旋研磨仪适配器中，最大转速涡旋振荡5min。 【涡旋振荡的机械作用力在打碎滤膜表面沉积物释放出截留细胞的同时辅助裂解细胞】 ⑶.室温4000g离心2 min。 ⑷.使用1ml枪头深入到底部吸取上清，并转移600ul上清到一个干净的1.5ml 离心管中。 ⑸.加入0.4倍体积的乙酸铵，混匀，冰上放置10min。 【移除腐植酸、细胞碎片、蛋白等非DNA 的有机、无机成分】 ⑹13000g离心1min。 避开沉淀转移上清到一个干净的2ml管中。 ⑺.加入等体积的DNA结合液，混匀。 【DNA 在高盐条件下将选择性地吸附到离心柱硅胶滤膜上 】 ⑻.加载650μl上清到一个离心柱硅胶滤膜中，13000g离心1min。弃去滤液重复上述步骤直到过滤完所有上清。 注意：通常需要加样两次。 ⑼.加入650μl膜洗涤液到滤膜中，13000g离心1min。 去掉滤液。重复⑽.把离心柱硅胶滤膜放到一个干净的1.5ml 离心管中。 ⑾.加入100μl洗脱液到离心柱白色滤膜中心。 【DNA在无盐条件下选择性地洗脱下来】 ⑿.13000g离心1min。 ⒀.弃去离心柱。DNA（-20℃-80℃）保存。 3.2.DNA的琼脂糖凝胶电泳检测 3.2.1制备琼脂糖凝胶 ⑴.按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表： 琼脂糖凝胶浓度/% 线性DNA的有效分离范围/kb 0.3 5~60 0.6