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基于原位电化学聚合的抑制作用生物传感器 蘸坯冒，贺圆圆，范泉 (扬州大学化学化工学院，扬州225002) 许多植物(特别是生的果蔬)受到机械损伤时在空气中会逐渐变成褐色，这是由于 损伤时植物细胞破碎，原来彼此分开的多酚氧化酶和酚类物质暴露在空气中并相互接触 反应，天然的酚化合物转换成醌，醌再聚合成黑色素所致。褐变除了会给果蔬带来不利 的颜色和风味，还使诸如抗坏血酸之类的营养成分遭到破坏。防止褐变的有效途径之一 是抑制多酚氧化酶的催化活性，因此研究多酚氧化酶的抑制作用和机理对生物和食品工 业有着重要的意义。 苯甲酸是多酚氧化酶的有效抑制剂之一…，也是食品中常用的一种防腐剂。测定苯 甲酸主要采用分光光度法、高效液相色谱法等口J，这些方法操作烦琐、费用高、难以实现 在线检测。采用酶电极来研究酶的抑制作用不仅简单、快速、节约酶试剂，而且还能实 现抑制剂的测定(基于抑制作用的生物传感器)。本文采用原位电化学聚合法制各性能稳 定的PAn／PAN-PPO酶电极，研究了苯甲酸对多酚氧化酶的抑制作用动力学以及抑制剂的 测定。 1．实验部分 聚丙烯腈(PAN)的合成采用稀土单组分催化剂Y(OAr)3催化丙烯腈的聚合。多孔的 聚丙烯腈采用相转移方法”埔0备。PAn／PAN-PPO酶电极的制备是将涂有多孔聚丙烯腈膜 的Pt电极浸入含0．1 M苯胺和2mg／ml多酚氧化酶的PBS中，然后再于此溶液中电聚合 苯胺。电解池采用三电极体系。随着电化学氧化的进行，苯胺将原位聚合在聚丙烯腈链 中，PPO也将同时嵌入到聚苯脚聚丙烯腈复合链中，从而形成了PAm，PAN．PPO电极。 得到的酶电极均用pH6．5的磷酸缓冲液充分洗涤后并贮存在此缓冲液(40C)中备用。 生物传感器响应得测定是采用安培法，测定是基于在．O．05v的电位下，酶催化反应产 生的醌被还原后产生的电流信号。结果与讨论电位控制在．50mV，儿茶酚的浓度在 10—200 uM范围内，在不同浓度的抑制剂中，PAn／PAN-PPO电极的响应电流随儿茶酚浓 度的变化如图1所示。图中曲线a、b、c、d、e分别代表抑制剂浓度为0、20、40、60、 100 V-M苯甲酸时的实验结果。从图中看出，在相同底物(儿茶酚)浓度下，响应电流随 着抑制剂浓度的增大而降低。在相同抑制剂浓度F，酶电极的响应电流随底物浓度的增 加而增大；而且当底物浓度增大时，对于不同浓度的抑制剂情况下，酶电极响应电流值 有逐渐靠近的趋势(趋于酶电极的最大响应电流值)。这说明了在高底物浓度F，原被抑 制荆占领的酶活化中心逐渐被底物竞争取代。根据图1的结果，作r1对l几茶酚】．1图，得 到五条相交于纵轴的直线，从直线的斜率和截距可求得表观米氏常数KM8”和最大响应电 流I…，其结果列于表1中。由表1看出，随着抑制荆浓度的增加，袭观米氏常数增大但 最大响应电流不变。由于反应速率与响应电流成正比，所以最大响应电流不变即为最大 反应速率不变，这正是竞争性抑制的特征141。由此数据还求得苯甲酸对多酚氧化酶电极 的抑制常数Ki为33．8州。 ∞ $帕 j 柚 【cilcch011／pM rhn—ctaal，ViM CalibrationcurvesofPAn／PAN-PPO Fig．1 Fig-2 R。1adonship electrodecatechol between．the for inPBS 0 containing inhibition andthe 州(a)，20vMC