养肝解毒丸微生物限度检查法的验证实验.docVIP

养肝解毒丸微生物限度检查法的验证实验 　　[摘要]目的建立适合养肝解毒丸微生物限度检查的方法，保证方法的科学性和检查结果的准确、可靠。方法按照《中国药典》2015年版四部规定的微生物限度检查法对微生物限度和控制菌进行检查，以5种试验菌的回收率对检验方法的有效性进行验证和确认。结果在3次独立的平行试验中，需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数验证中各试验菌每次试验的比值在0.5～2的范围内；试验组可以检出控制菌大肠埃希菌和乙型副伤寒沙门菌。结论需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数检查采用薄膜过滤法，控制菌检查可采用常规法。 　　[关键词]养肝解毒丸；微生物限度检查；方法学验证 　　微生物试验的结果易受试验条件的影响，特别是制剂中含有较强的抑菌成分时，只采用常规方法进行微生物限度检查，其结果不能真实反映其污染的微生物状况Ⅲ。口服制剂中微生物污染状况的控制是药品质量控制的重要指标。中药口服制剂尤其易受到微生物的污染，因此中国药典2015年版四部通则中规定微生物限度是中药丸剂的必检项目。 　　近年来，关于中成药微生物限度检查的方法学验证试验的报道表明，通过方法学验证试验可以消除药物的抑菌作用，使检验结果更具有效性。养肝解毒丸是由山药、龙胆草、败酱草、夏枯草、灵芝、牡丹皮、山茱萸等十二味中药组方组成的复方制剂。其主要功能是滋肾，解毒。现根据《中国药典》2015年版四部微生物限度检查法规定，必须对其检查方法进行验证，笔者通过对养肝解毒丸进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数及相关控制菌的测定建立了适合的微生物限度检查方法并对方法进行验证，确保了检测方法的可行性。 　　1试验材料 　　1.1仪器 　　GNP-9270BS-Ⅲ型隔水式恒温培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；SPX-150B-Z型生化培养箱，上海博讯实业有限公司；101A-1型数显电热鼓风干燥箱，深圳市亿博兰电子有限公司；MLS-3780型高压蒸汽灭菌器，日本三洋。 　　1.2试药 　　养肝解毒丸（泰安市中医医院，批号：151201，151202，151203）。 　　1.3培养基 　　胰酪大豆胨琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3104593）；胰酪大豆胨液体培养基（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3104633）；沙氏葡萄糖琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3104369）；沙氏葡萄糖液体培养基（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3103279）；肠道菌增菌液体培养基培养基；（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3104601）；紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3104591）；麦康凯液体培养基（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3104449）；麦康凯琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3104517）；RV沙门菌增菌液体培养基（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3104566）；木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3104616）。 　　1.4稀释剂、冲洗剂 　　氯化钠一蛋白胨缓冲液（北京陆桥技术有限责任公司，批号：140424）、0.9%无菌氯化钠溶液。 　　1.5菌种 　　实验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 　　以下菌株均购自山东省食品药品检验研究院（符合药典标准规定）。 　　金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003第4代]；铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104第4代]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501第4代]；大肠埃希菌[CMCC（B）44102第4代]；乙型副伤寒沙门菌[CMCC（B）50 094第4代]；白色念珠菌[CMCC（F）98 001第4代]；黑曲霉[CMCC（F）98 003第4代]。 　　2验证方法与结果 　　2.1菌液的制备方法 　　取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌和沙门菌的新鲜培养物至10mL胰酪大豆胨液体培养基中，将上述各培养基均置于隔水式恒温培养箱（30～35℃）中培养18～24h。分别取各培养物1mL，加0.9%无菌氯化钠溶液9mL，10倍递增稀释制成每毫升含菌数为小于100cfu的菌悬液。 　　取白色念珠菌的新鲜培养物至10mL沙氏葡萄糖液体培养基中，置生化培养箱（20～25℃）培养2～3d，取培养物1mL，加0.9%无菌氯化钠溶液9mL，10倍递增稀释制成每毫升含菌数小于100cfu的菌悬液。 　　取黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基中，置生化培养箱（20～25℃）培养5～7d，使大量的孢子形成。用5mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶