塞来昔布抑制非小细胞肺癌肿瘤增殖及血管生成效果的实验研究.docVIP

塞来昔布抑制非小细胞肺癌肿瘤增殖及血管生成效果的实验研究 　　[摘要]目的探讨塞来昔布抑制非小细胞肺癌肿瘤增殖及血管生成的效果。方法48只裸鼠建立非小细胞肺癌模型后，分为两组，均使用含有塞来昔布的饲料喂养，观察组则联合使用浓度为100μmol/L的塞来昔布治疗，持续120d后，比较两组细胞增殖情况及血管内皮生长因子水平和微血管密度。结果观察组72h抑瘤率高于对照组（P0.05），细胞凋亡染色率（TUNEL法）高于对照组（P0.05），血管内皮生长因子整体水平低于对照组（P0.05），微血管密度低于对照组。结论对非小细胞肺癌大鼠，使用100μmol/L塞来昔布治疗能较好的抑制肺癌肿瘤细胞的增殖以及新生血管的形成，且随着时间的延长，抑瘤率提高。 　　[关键词]塞来昔布；非小细胞肺癌；肿瘤增殖；血管生成；实验研究 　　以往研究已经证实，COX-2的表达与多种实体恶性肿瘤存在相关性，针对非小细胞肺癌患者，其同样呈现阳性表达，而且COX-2的高表达性，预示着肿瘤细胞具有较强的侵袭性以及早期的淋巴转移倾向。其机制包括：促使肿瘤细胞的增殖抑制凋亡、促进肿瘤组织新生血管的形成同时抑制机体免疫反应等。目前多数学者认为非甾体抗炎药物可在体内及体外均起到抑制人非小细胞肺癌的增殖的作用，尤其是塞来昔布治疗后，一般于4周左右，肺癌肿块出现明显缩小，其发生转移时间延长，几率降低。鉴于目前对于使用非甾体抗炎药物辅助治疗非小细胞肺癌尚无推荐剂量。本研究主要通过比较新型非甾体抗炎药物一塞来昔布对肿瘤细胞增殖及对血管生成的影响，探讨其治疗非小细胞肺癌的临床效果，现报道如下。 　　1资料与方法 　　1.1材料及试剂来源 　　所选人肺腺癌A549细胞株购置于上海微生物细胞研究所。所选塞来昔布由安徽合肥森瑞化工有限责任公司生产，Annexin V-FITC凋亡试剂盒由美国PharMingen公司提供，噻唑蓝试剂由华美生物材料公司生产，DMEM培养基由美国GIBCO公司提供，细胞原位凋亡检测试剂盒由美国瑞驰生物公司提供。二氧化碳孵育箱由美国NAPCOInternational Corporatio提供，倒置型电子显微镜由日本奥利巴斯公司提供，Epicsrxl型四色流式细胞仪由美国贝克曼库尔特公司提供，Mr5000型全自动酶标仪由美国Dynatech公司提供。 　　1.2细胞培养及建模 　　细胞培养首先将人肺腺癌A549细胞置于13%灭活小牛血清DMEM培养基内，于37℃5%二氧化碳及40%湿度条件恒温箱内，保持培养基内青霉素和链霉素浓度控制在100U/mL。裸鼠建模：将含有2×106细胞数的细胞悬液200μL分别注入6周龄裸鼠右前肢腋下，并将人组48只裸鼠进行随机分为两组，每组各24只，并于接种肿瘤细胞后第2天开始服用药物，均使用含有塞来昔布1250mg/kg的饲料喂养，连续喂养120d，喂养期间对裸鼠精神食欲及排便情况进行观察并记录，每周对裸鼠体重及肿瘤大小进行监测。肿瘤体积计算（单位：mm3）=短径2x长径/2，120d后使用空气注射法处死裸鼠，对肿瘤结节称重并测量其体积。 　　1.3塞来昔布对A549细胞增殖作用的影响 　　观察组将对数生长期人肺腺癌A549细胞5x103个/孔接种至96孔培养板内，分别于24h及72h后，观察组塞来昔布浓度为100μmol/L，加入助溶剂DMSO 5mL，对照组使用相同剂量的生理盐水，培养液含有助溶剂DMSO 5mL，37℃40%湿度条件恒温箱内培养4h，去除培养液后加入150μL助溶剂。使用全自动酶标检测仪测定A 549nm值，计算两组细胞生长抑制率（对照组A 549nm-观察组A549nm）/对照组A 549nm]x100%。通过肿瘤结节重量计算抑瘤率：[1-（观察组肿瘤结节质量/对照组肿瘤结节质量）1x100%。采用TUNEL法测定肿瘤细胞凋亡情况，并使用400倍高倍镜观察。 　　1.4两组血管内皮生长因子水平及微血管密度检测 　　均采用免疫组化实验SP法进行，通过石蜡包埋并制备成厚4μm石蜡切片。分别进行常规HE染色和光镜检查，以及脱蜡与水化处理，血管内皮生长因子中免疫组化阳性为棕黄色，测定并计算平均吸光度。微血管密度计数采用Tanaka法进行，将肿瘤区内染成棕黄色单个内皮细胞或内皮细胞簇视为1个血管计数，由低倍镜下确定5个高血管密度区，并确定为1个“热点”，于高倍镜下计算被染成黄色微血管平均数。 　　1.5统计学处理 　　应用SPSS13.0进行统计学处理，计量资料以（x±s）表示，两组间均数的比较使用t检验，组间率的比较采用x2检验，P0.05为差异有统计学意义。 　　2结果 　　2.1两组24h及72h抑瘤率比较 　　对照组24h抑瘤率为（7.20±2.58）%，72h抑瘤率