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第21分会场 生物技术产业化477 一：——————————；——————#——#—#—————#—————————#—————# 基因工程单链抗体及其运用 汪世华 福建农林大学生命科学学院，福州，350002 摘要单链抗体是用基因工程方法将抗体重链可变区和轻链可变区通过一段连接肽连 接而成的重组蛋白，是保持了亲本抗体的抗原亲和活性和特异性的最小功能性抗体片段；scFv 成为将药物、毒索、放射性毒素导向肿瘤的很有价值的分子。 关键词 基因工程 单链抗体噬茵体展示 融合蛋白 人源化抗体小分子抗体的出现开创了基因工程抗体技术，标志着第三代抗体——基因工程抗体的 诞生。单链抗体(scFv)和噬菌体抗体库的出现，克隆可变区基因，将抗体设计成既具有抗原亲活性又排 除了Fc段所致的免疫复合物反应的抗体，而成为基因工程抗体研究领域中的热点。 一、基因工程单链抗体技术 (一)单链抗体基因的获取和构建 ． 变区V。．基因，或直接从感染某种或接触某种抗原的外周血淋巴细胞中分离V基因，用PCR扩增V。、 V。．基因，用限制性内切酶切下VH、V。的DNA片段，然后克隆到载体上。构建组合文库，以获得具高亲 和力抗体。ScFv用两个片段将接头的编码序列分别设计在扩增V。、V．。的引物中，并使这两个引物有 15个碱基以上的互补序列，将V。和V．．扩增产物混合，经变性、复性及DNA聚合酶催化的延伸反应， V¨和V。．通过所设计的互补序列，互为引物及模板合成完整的scFv基因，再以两端的引物进行PCR扩 增，即可得到足够的scFv基因产物。 (二)单链抗体库的构建 噬菌体表面展示技术是Smith GP在1985年建立的，其主要特点是将特定分子的基因型和表现型 统一在同一病毒颗粒内。该技术的成功给抗体基因的筛选工作带来了革命性的变革。 1．噬菌体展示技术的基本原理 外源DNA片段能被插入到丝状噬菌体基因组的一个外被蛋白的基因中，这个外源DNA片段所编 码的氨基酸序列可与此外被蛋白一起以融合蛋白的形式表达，并显示在噬菌体的表面。噬菌体表面展 示文库技术的要点是从B细胞中分离抗体可变区基因，PCR扩增抗体全套基因片段(如V。，V。)，将体 外扩增的VH、V乙基因片段随机克隆入相应载体，形成组合文库。将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋 白的基因3或基因8的先导序列的紧靠下游，使外源基因表达的多肽以融合蛋白的形式展示在外壳蛋 白PIlI或pⅧ的N端。 2．用于噬菌体展示的表达载体 用于噬菌体展示的表达载体可分为两类：丝状噬菌体和以这些噬菌体复制起始点序列为基础组建 478 以科学发展观促进科技创新(下) 的噬菌粒。丝状噬菌体的外被蛋白基Ⅲ和基因Ⅷ是常用的与外源DNA序列一起产生融合蛋白的基 因。基因Ⅲ称为少量外被蛋白基因，基因Ⅷ称为主要外被蛋白基因。通常情况下，与PⅧ融合表达的蛋 白或多肽呈多价，而与PIlI融合表达的则呈单价，因此可用PⅧ蛋白基因组建的噬菌体展示系统筛选低 亲和性的配体，而用PⅢ融合表达系统筛选高亲和性的配体。 (三)抗体库的淘选 其基本原理是将抗体片段和M13噬菌体的基因Ⅲ(P1]I)或基因Ⅷ(PⅧ)融合表达在丝状噬菌体的 表面，再以抗原为配基，通过吸附一洗脱一扩增的富集过程，筛选到与抗原特异结合的抗体克隆。这一 步的关键是富集方法的选择，抗体库的富集方法包括固相富集和液相富集两种。固相富集是利用包被 在固相载体上的抗原结合呈现在噬菌体表面上的功能抗体而实现的。它的优点是重复性好。液相富集 是利用生物素标记的抗原在溶液中结合表面呈现功能抗体的重组噬菌体，从而实现对抗体库中功能抗 体的富集。液相富集有利于保持抗原的天然构象，从而能够以低浓度抗原筛选到高亲和力抗体。 (四)单链抗体的改体 在scFv基础上，现已发展了几种性能较好的小分子抗体。dsFv是通过在Fv的V¨和v，框架区的 的接头缩短，迫使二个分子间的VH和V。配对形成双价小分子抗体，其结合性能优于单价分子。如果 的V。。与V。之间引入二硫键形成的。相对于scFv，它有更好的稳定性。除此以外，人们还设计了多