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发酵工程学科的进展 ——第四班奎固发酵工程学术讨静鲁论文寨 基因芯片在酵母展示人源蛋白中的应用 唐语谦，林影。 (华南理工大学生物科学与工程学院，广州510640) 摘要：将人源蛋白酶体a亚基6展示表达于酵母表面，并实现不同水平的表达，采用酵母 全基因组cDNA芯片检测了各表达水平下酵母功能基因的表达水平区别。结果显示低表达 样B与对照样A相比，差异显著表达基因共有385条，己知基因338条．新基园47条．巳知 基目中上调基目201个，下调基因137条。高表达样C与对珊样A相比．差异显著表达基因 共有139条，巳知基因i12条，新基因27条。巴知基因中上调基因67个，下调基因29条。 因此，基匿表遗谱芯片技术可以筛选出酵母展示八源蛋白表达的相关基因群，对其进一步研 究有助于指导展示目标蛋白的发酵培养条件优化。 关键词：人源蛋白酶体a亚甚6；酵母展示l基因芯片 前言 随着人类基因组计划转向后基因组时代，基因芯片技术的微型化、集约化和标准化 的特点，在分子生物学研究、医学临床检验、生物制药领域和环境学等领域显出超凡的生 命力o]。一般认为在机体中存在溶酶体蛋白酶途径、钙依赖的蛋白酶途径和ATP-泛素一 蛋白酶体途径三种蛋白降解的通路。26S蛋白酶复合体介导的蛋白降解途径是真核细胞 内主要非溶酶体降解途径之一．它参与调控细胞周期、细胞分化、胚胎发生、抗原呈递等 内环组成，大多数学者认为，催化中心位于口环上，a亚基的主要功能是识别底物o]。 目前蛋白酶体的抑制剂是治疗很多疾病的重点研究方向，我们通过酵母展示系统将 subunlt 人源蛋白酶体口亚基6(Proteasomealpha6)展示在酿酒酵母MT8—1表面，希望 获得高水平表达以研究该人源蛋白在ATP一泛索一蛋白酶体降解蛋白通路中的生理意 义。实现目标蛋白的不同水平表达后，我们通过酵母全基因组cDNA芯片检测酵母功能 基因的表达水平区别，筛选在酵母表面展示外源蛋白过程中，与表达水平高低相关的主 要功能基因，通过聚类分折研究其参与的生理途径和功能，从而进一步指导提高展示表 达水平的发酵培养条件优化。 1材料与方法 1．1研究对象 *通讯作者：电子邮箱地址：feylin@SCUt．edu．cn 第四次全国发酵工程学术讨论会 亚基6基因，S．cerevisiae c三种培养方法获得不表达、低表达和高表达，见表l。 裹1 ofthe oilthesurface ProjeelsproteinsdIsplay of删 1．2重组酵母表达量测定 monoelonaI 以His．Tag antibody为一抗，重组酵母菌d6经免疫荧光标记，流式细胞 仪检测荧光，流式细胞仪检测的平均荧光强度反映人源蛋白酶体a亚基6的表达量。 1．3酵母RNA的提取 采用热酸性酚的方法提取新鲜培养的酵母RNA，经纯化和定量，电泳质检。 1．4芯片杂交与数据分析 采用北京博奥公司生产的酵母eDNA微阵列芯片进行基因表达谱差异的检测。取 10KA双通道激光扫描仪和LuxScan3．0软件(CapitalBio)扫描和对芯片图像进行分析， 转为数字信号，经Lowess归一化和t检验结合两倍差异标准确定差异表达基因。 2结果与讨论 2．1流式细胞仪检测蛋白酶体n亚基6在酿酒酵母MT$-l表面的展示 用流式细胞仪检测重组酵母苗a6和pl标记的荧光强度，在方直图上，方法A培养 的n6相对于pI荧光峰没有漂移，不表达目标蛋白；方法B培养的a6相对于pI荧光峰部 分漂移，目标蛋白表达量较低}方法c培养的a6相对于pI荧光峰出现完全明显的漂移， 目标蛋白表达量高。 2．2酵母cDNA微阵列芯片检测 以A作为对照样，将B和C分别与芯片杂交，包括荧光交换的4组芯片杂交结果显示， 所有阳性对照(管家基因)的杂交信号清晰，阴性对照的杂交信号都很低，证实数据的可靠 性。按差异显著性标准，B与A相比，在研究的4109条基因中表达差异达95％以上为 137条