实时荧光定量PCR构建PrP基因标准曲线.pdfVIP

第27卷增刊 内 蒙 古农业 大学学报 V01．2702S 2005年7月 2005 ofInner Jul journal MongoliaAgriculturalUniversity 文章编号：1009—3575(2005)02S一0055—0l 实时荧光定量PCR构建PrP基因标准曲线。 CONSTRUCTIONOFPRPGENESTANDARD CURVEUSINGREAL—TIMERT—PCR 韩彩霞．赵德明 (中国农业大学国家动物海绵状脑病实验室，北京 100094) 常的朊蛋白与致病性朊蛋白具有相同的氨基酸序列，其空间结构发生变化后由正常的以a螺旋为主的结构 欧洲流行了大约250年，但是它的流行病学及传播机制尚不清楚。 研究显示，不同组织来源的细胞中朊蛋白的表达程度差异很大，主要出现于神经细胞中。正常的朊蛋白 (PrPo)不能引起神经退行性病变，虽然目前已经对许多组织的PrPmRNA进行了检测，但是对它的生物学 功能还知之甚少，对PrP基因表达的机制尚不清楚。对于人和动物的朊蛋白疾病，prpsc的积累在发病机理 mRNA 的转录机制还没有阐释清楚。 细胞型朊蛋白在许多细胞和组织中都可以表达，朊蛋白的这种表达可能对朊蛋白疾病的发病机理有很 重要的作用。细胞型朊蛋白的高表达量能够增加PrP。向prpsc转化的危险性。以往的研究是用原位杂交或 各个组织器官中PrPmRNA表达量的前提是构建标准重组质粒和标准曲线，本试验采用实时荧光定量PCR JMl09，挑取单个白色菌落筛选得到重组质粒，对重组质粒进行酶切、质粒PCR和测序鉴定证实质粒构建成 功，结果表明已经成功克隆绵羊PrP基因片段。为了对绵羊各个组织器官PrPmRNA的表达量进行定量， 利用实时荧光定量PCR技术，以10倍系列稀释的重组质粒作为标准品制定标准曲线。 ／ 本试验中的循环阈值(Ct值)相对固定，重复性好，以不同浓度标准品重组质粒DNA分别进行实时荧光 定量PCR扩增，发现起始浓度越高，ct值越小，即起始模板浓度与Ct值之问呈良好的线性关系。利用已知 起始拷贝数的标准品重组质粒可做出标准曲线，因此只要获得未知样品的ct值，即可从标准曲线上计算出 该样品的起始拷贝数。本试验中，通过10倍系列稀释标准品重组质粒制定的定量标准曲线循环阈值与模板 浓度具有良好的线形关系，根据此标准曲线，计算机可计算出各样品模板的初始含量。实时荧光定量PCR PrP标准品重组质粒和标准曲线的建立，为进一步研究朊蛋白疾病的发病机理奠定了基础。 ’怍@者m筒131介“：；嚣譬i?i采生】，女．．在读博士生，研究方向；兽医痛理学