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第四模块 色谱检测技术 第二节 液相色谱法 学习目标 知识目标： 理解高效液相色谱法的含义及特点；掌握常用术语；理解高效液相色谱仪的结构组成；掌握高效液相色谱法的主要应用。 技能目标： 能使用高效液相色谱仪对药物进行分析。 复习提问 新课大纲 本章主要内容 一、概述及基本原理 二、色谱条件检测器 三、定性和定量方法 四、在药物分析中的应用 一、概述及基本原理 是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。  与经典液相色谱法一致。 1.按固定相的聚集状态不同分为: 液-固色谱法和液-液色谱法。 2.按分离原理不同分为: 吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱法四类。 ①不但具有高效、高速、高灵敏度的特点 ②还由于它的流动相（载液）种类比气相色谱的流动相（载气）多，因此可选用两种或多种不同比例的液体作流动相，可提高选择性。 ③此外，液相色谱的馏分比气相色谱易于收集。便于为红外、核磁等方法确定化合物结构提供纯样品。 思考：为什么用高压泵？ 因为填料颗粒小，具有高的柱效，但会引起高阻力，因此用高压输送流动相。 ⑶色谱柱： 由柱管（不锈钢） 和固定相（化学键合相：药物分析中90%用反相键合相，如C18)组成 （1）紫外检测器 　　该检测器适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样品的检测。其特点：使用面广（如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；灵敏度高（检测下限为1-10μg／ml）；线性范围宽；对温度和流速变化不敏感；可检测梯度溶液洗脱的样品。 （2）示差折光检测器　　凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测。目前，糖类化合物的检测大多使用此检测系统。这一系统通用性强、操作简单，但灵敏度低（检测下限为10-7g／ml），流动相的变化会引起折光率的变化，因此，它既不适用于痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品的检测。 三、定性和定量方法 定性参数：保留时间。 定量参数：峰高或峰面积。 1）内标物的要求：在样品中不存在、与样品完全分离、与待测物保留时间接近、与待测物峰大小相近、不与待测物中各组分发生化学反应、很纯且贮在职　稳定。 2）面积比＝样品峰面积 　　　　　 内标峰面积 样品浓度＝样品面积比　　×标准品浓度 　　　　　 标准面积比 测杂质时常采用此法） 1)先用纯品测校正因子，因检测器对各组分灵敏度不同，使相同质量的不同组分得到的峰面积不同，因此需用校正因子。 2)要求所有组分必须流出并能检测，计算待测组分占总峰面积的比值。 Ci%= Aifi .100% ∑ Aifi 四、在药物分析中的应用 （一）在药典中应用的情况 1.鉴别： 以供试品与对照品的保留时间一致进行鉴别。如头孢、林可、可的松 2.检查： 用于检查有关物质、分解产物，如乙烯雌酚：1ml含0.5mg和1ml含0.01mg，记录至主成分保留时间的2倍，溶液1显示的杂质峰数不得超过4个，各杂质的峰面积及其总和分别不得大于溶液2主峰面积的1/2和1/3。 3.含量测定：列出色谱条件、系统适用性试验 (三)在中草药分析中的应用 测定前先提取分离有效成分，再测定　 1.提取净化方法：溶剂提取、超声、固相萃取柱（加压使样品进入柱再水、甲醇洗，收集醇　液进样） 2.测定药物：如复方甘草冲剂中的甘草酸和绿原酸 (四)体内药物分析 血中、尿、胆汁、乳汁、脏器 本课小结 课后习题 ⑷检测器： （3）荧光检测器 　　凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此，这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定，其灵敏度很高（检测下限为10-12～10-14g／ml），痕量分析和梯度洗脱作品的检测均可采用。 （4）. Model 6000二级管阵列紫外检测器 1.外标法：一系列浓度不同的标准品，准确进样，得色谱图，用峰面积或峰高与浓度绘制校准曲线，由其回归方程计算样品的浓度。（样品溶液的浓度用样品峰与标准品峰的直接面积比计算。） 样品浓度＝样品峰面积　　×标准品浓度 　　　　标准品峰面积　　 含量测定： 要求： 1）精密度与进样量有关，进样量重复性好能得到好的精密度 2）严格控制实验条件，仪器稳定，如流速、温度 2.内标法： 已知量的纯物质作内标物，加至准确称量样品和标准品中进行测定。 3）优点：只要被测组分及内标物出峰就可定量、与进样量的重复性无关、