木犀草素联合替莫唑胺对脑胶质瘤大鼠VEGF表达的影响.docVIP

木犀草素联合替莫唑胺对脑胶质瘤大鼠VEGF表达的影响 　　[摘要]目的研究木犀草素联合替莫唑胺对脑胶质瘤大鼠VEGF表达的影响。方法建立大鼠U87-MG脑胶质瘤模型，以随机数字表法分为四组，每组20只。接种14d后给予替莫唑胺组替莫唑胺25mg/（kg?d），木犀草素组木犀草素20mg/（kg?d），联合组给予木犀草素20mg/（kg?d）、替莫唑胺25mg/（kg?d），均配置为2mL生理盐水溶液后腹部注射，空白组每天给予等量生理盐水。给药5周后将脑胶质瘤细胞切片染色，免疫组化法检测各组大鼠脑胶质瘤细胞中VEGF水平。结果联合组VEGF阳性与强阳性表达数量之和所占比例为20%，与空白组、木犀草素组、替莫唑胺组85%（x2=16.942）、70%（x2=10.101）、55%（x2=5.227）相比均明显下降（P0.05）。结论木犀草素联合替莫唑胺治疗U87-MG脑胶质瘤，可有效抑制肿瘤VEGF表达，对脑胶质瘤的化疗效果起增敏作用。 　　[关键词]木犀草素；替莫唑胺；脑胶质瘤；VEGF 　　脑胶质瘤为神经系统中最常见的原发性肿瘤，恶性居多且极具浸润性、侵袭性，治疗困难且易复发，大多数患者预后不良。临床普遍采用手术切除联合放疗、化疗等手段的综合治疗策略。尽管目前对脑胶质瘤的治疗已取得长足进步，但治疗仍缺乏突破性进展。有研究显示肿瘤血管内皮因子（VEGF）在肿瘤生长中起重要作用，因此VEGF的表达抑制也成为肿瘤治疗的重要方向。近年来。替莫唑胺作为一种新型化疗药物已于胶质瘤的治疗中广泛应用，可明显延长恶性胶质瘤患者进展存活时间。但该药仍存在较重的化疗毒副反应，且难以通过血脑屏障，治疗效果不够理想。为探究新型化疗方案以提升替莫唑胺的化疗效果，本研究建立大鼠脑胶质瘤模型，并应用木犀草素、替莫唑胺联合治疗，观察VEGF表达变化，现报道如下。 　　1材料与方法 　　1.1实验动物 　　实验所用wistar成年雄性大鼠均由中国医科大学动物实验中心提供，符合临床实验标准，月龄18月，体重200～230g，发育健康。 　　1.2细胞株 　　本研究采用大鼠U87-MG胶质瘤细胞株，购于中国科学院上海细胞生物学研究所。 　　1.3仪器与试剂 　　CO2细胞培养箱（HERAcell 2401）由美国赛默飞公司提供，SW-CJ超净台购于苏州零三净化设备有限公司。DMEM培养基、胎牛血清（FBS）均从Gibco公司购置，离心机由美国Sigma公司提供，木犀草素由Sigma-aldrich提供，替莫唑胺为江苏天士力帝益药业有限公司生产（。 　　1.4实验方法 　　1.4.1细胞处理与悬液制备在含有10%FBS的DMEM高塘培养基中培养U87-MG细胞，在细胞生长处于对数期时加入不含FBS的DMEM培养基制成细胞悬液，保持每10μL含1x106个C6细胞。将悬液离心，取下层细胞备用。 　　1.4.2大鼠接种接种前需将大鼠以10%的水合氯醛麻醉处理，固定其头部于脑立体定位仪并分离显露颅骨，以大鼠右侧脑尾状核为注射靶点，保持1μL/min的速度注射10μL C6细胞悬液。矢状缝右侧3cm，深5cm。注射完全后以生理盐水冲洗，缝合切口。接种14d后可开展给药实验。 　　1.4.3分组及用药方法按照随机数字法将80只大鼠分为四组，每组20只。替莫唑胺组每天给予替莫唑胺25mg/kg，木犀草素组每天给予20mg/kg，联合组每天给予木犀草素20mg/kg、替莫唑胺ZSmg/kg。均以生理盐水配置为2mL溶液，空白组不给予药物，每天注射生理盐水100mL/kg，经腹腔注射，连续给药两周。 　　1.4.4检测方法5周后将所有小鼠以过量麻醉剂处死，多聚甲醛灌注至动脉血管，并观察大鼠脑部胶质瘤生长状况。采用免疫组化实验分别测定四组VEGF表达水平，将胶质瘤组织冠状切面后DAB染色测定，严格遵循试剂盒操作说明。经图像分析处理以后灰度计算目标视野中阳性染色的单位面积。阳性细胞标准为细胞质内有橙黄色颗粒，综合染色强度与阳性细胞比例确定阴性（一）、弱阳性（+）、阳性（++）和强阳性（+++）数量。 　　1.5统计学方法 　　本研究数据均采用SPSS17.0软件处理分析，计数资料的组问比较行X2检验，以P0.05为差异有统计学意义。 　　2结果 　　2.1四组VEGF表达结果比较 　　联合组阳性与强阳性数量之和所占比例为20%，与空白组、木犀草素组、替莫唑胺组85%（x2=16.942，P0.05）、70%（x2=10.101，P0.05）、55%（x2=5.227，P0.05）相比均明显下降，见表1。 　　2.2VEGF染色图像比较 　　四组大鼠于接种4周后出现不同程度的消瘦、反应迟缓的脑胶质瘤症状，至第5周时症状