川芎甜菜碱醛脱氢酶cDNA的克隆及其植物表达载体的构建.pdfVIP

北方 园艺2013(05)：87～90 ·生物技术 · 川芎甜菜碱醛脱氢酶 cDNA的克隆及 其植物表达载体的构建 毛 莹 ，张 艳 军 ，王 万 军 ，陈 劲 松 ，廖 海 ，周 嘉 裕。 (1．西南交通大学 生命科学与工程学院，四川 成都 610031；2．中国科学院成都生物研究所，四川 成都 610041) 摘 要：以川芎为试材，从叶片中提取总 RNA，经过 RT-PCR获得甜菜碱醛脱氢酶 (Betaine aldehydedehydrogenase)基 因的cDNA，纯化后与pMDI8一T栽体连接，转化大肠杆菌Top10，获得 甜菜碱醛脱氢酶全长基因序列，以期构建植物表达载体。结果表明：甜菜碱醛脱氢酶全长核苷酸 长度为1527bp，编码 508个氨基酸。与OenBank中已发表序列HM35276进行比较 ，核苷酸同源 性为 100 。将该基 因片段克隆到植物表达载体 pBI121中，构建重组质粒 pBI121／Betainealde- hydedehydrogenase，并将所获重组质粒经过双酶切和 PCR处理后进行序列测定，证 实表达载体 上含有 目的片段 ，且连接、构建正确，为BADH 的进一步表达奠定了基础。 关键词：川芎；甜菜碱醛脱氢酶；克隆；植物表达载体 中图分类号：s567．239 文献标识码 ：A 文章编号：1001--0009(2013)05一O087—04 川芎(LiqusticumchuanxiongHort．)属伞形科多年 显高于对照，干草增产率明显提高[4]。并且甘氨酸甜菜 生草本植物，其干燥根茎，为我国传统中药材，对治疗冠 碱合成过程简单 ，遗传操作方便，因此选择对甘氨酸甜 心病 、L,N缺血等心血管疾病有明显疗效[1]。川芎生长 菜碱合成酶基因进行分离和转化可提高植物低温胁迫 喜低温，尤其是川芎苓种只能在低温的高海拔山区 环境下的生长能力[5j。 (1500m)进行繁育 (时间长达 200d)，具有较强的适应 迄今为止 ，对川芎的研究仅限于药理、生理等方 低温的能力，也是开展植物抗低温研究 的重要 资源植 面。关于川芎抗逆的生化研究尤其是甜菜碱生物合成 物_2]。大多数高等植物在受到低温胁迫时常常会合成 途径及关键酶基因的研究尚未大力展开。课题组曾利 并累积甘氨酸甜菜碱、脯氨酸和可溶性糖等渗透调节物 用 RT-PCR和RACE方法从川芎叶片中分别分离了川 质来提高细胞渗透压 ，这对抵御严寒具有重要作用。其 芎BADH基因的 5、端片段、3、端片段 以及 中间片段的 中，甜菜碱是最主要的渗透调节剂之一[3]。由于甜菜碱 cDNA序列，通过软件拼接得到 目的基 因全长序列 醛脱氢酶 (Betainealdehydedehydrogenase，BADH)是合 (GenBank登录号 ：HM35276)_l7]。为了从分子水平对川 成甘氨酸甜菜碱途径中的关键酶。将BADH基因转入 芎的抗逆能力进行探究，充分利用其耐低温基因，并期 到苜蓿中，获得了具有抗盐碱能力的转基因苜蓿稳定株 望通过转基因手段在 目标植物中发现一条较完善的甜 系。通过品种 比较试验、区域试验和生产试验 ，表明在 菜碱合成途径。该试验根据川芎BADH基因的cDNA 不同盐碱地条件下，转BADH基因的苜蓿植株产草量明 序列，根据软件设计并合成特异引物 ，从川芎叶片中提 取川芎BADH总RNA，经过反转录获得川芎BADH全 第一作者简介：毛莹(1991一)，女，在读硕士，现主要从事植物资源 长cDNA，PCR大量扩增且测序正确 ，构建植物表达载 及生物技术等研究工作。E-mail：9