12高效液相色谱法.doc.doc

教 案 教 师 姓 名 授课班级 授课形式 讲 授 授 课 日 期 授课时数 2 授课章节名称 高效液相色谱法 教 学 目 的 1.熟悉高效液相色谱法的主要类型，化学键合相色谱法及其流动相、固定相的选择；高效液相色谱法速率理论的特点及分离条件的选择，高效液相色谱仪的主要部件，定性与定量分析方法。 2.了解高效液相色谱法与经典液相色谱法、气相色谱法的区别，其他类型高效液相色谱法在分析中的应用。 教学重点难点 高效液相色谱仪的基本结构及仪器的基本操作方法 更新、补充 删节内容 使 用 教 具 课 外 作 业 P26 思考题1,2 课 后 体 会 审 阅 评 语 审阅人 授课时主要内容或板书设计 [引入新课]、[讲解新课] 第12章 高效液相色谱法 第一节 概 述 高效液相色谱法（HPLC）的特点： 以经典液相色谱法为基础 引入气相色谱法的理论和实验技术 高压输送流动相 高效固定相及高灵敏度检测器 现代液相色谱分析方法（具有分离、分析双重作用） 第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理 一、主要类型 化学键合相色谱法 离子抑制色谱法 离子对色谱法 离子色谱法 亲合色谱法 二、化学键合相色谱法 以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合相色谱法(BPC)。 化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相。 键合相色谱法的优点： 固定相的均一性和稳定性好，使用过程中不易流失，使用周期长； 柱效高；重现性好； 能使用的流动相和键合相的种类多，分离的选择性高。 键合相色谱法的分类: 根据化学键合相与流动相极性的相对强弱分类： 正相（NP）键合相色谱法 反相（RP）键合相色谱法 授课时主要内容或板书设计 三、其他高效液相色谱法 （一）离子抑制色谱法（ISC ） 通过调节流动相的pH，抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解度，改善峰形，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的。 （二）离子对色谱法（IPC） 把离子对试剂加入到含水流动相中，组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子生成中性离子对，增加溶质与非极性固定相的作用，使k增加，改善分离效果。 （三）离子色谱法（IC） 离子交换色谱法对许多正、负离子可实现分离。但由于一些常见的无机离子在可见或近紫外区没有吸收，因此难用紫外-可见检测器进行检测。1975年Small提出了将离子交换与电导检测器相结合分析各种离子的方法并称为离子色谱法。 （四）亲和色谱法（AC） 亲和色谱法是将具有生物活性的配位基键合到载体或基质表面形成固定相，利用蛋白质和生物大分子与固定相表面上配位基的专属性亲和力进行分离的色谱方法。 第三节　高效液相色谱法的固定相和流动相及选择 一、固定相 HPLC的固定相多采用化学键合相。 二、化学键合相的流动相 第四节　　高效液相色谱仪 一、 组成： 输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据记录处理系统 授课时主要内容或板书设计 第五节 定性与定量分析方法 一、定性分析方法 二、定量分析方法（同GC）： (一)外标法 外标法是用待测组分的纯品作对照物，配制一系列不同浓度的标准液，进行色谱分析，以峰面积对浓度作工作曲线。在相同操作条件下，对试样进行色谱分析，算出样品中待测组分的峰面积，根据工作曲线即可查出组分的含量。 外标一点法:当待测样品中被测物的含量范围波动不是很大时，可以采用直接比较法进行分析 (二)内标法　将一种纯物质作为内标物加入到待测样品中，进行色谱定量的方法称为内标法。组分含量计算公式为： 内标对比法（内标一点法）：先将被测组分的纯物配制成标准溶液，定量加入内标物；再将同量的内标物加至同体积的样品溶液中，将两种溶液分别进样测定，按下式计算组分含量： 【含量测定】2005年版二部－354 维生素A 取本品适量,精密称定，加正己烷制成每1ml中约含45单位的溶液，照维生素A测定法(附录VII J)中的高效液相色谱法测定。 维生素D3 取本品2g，照维生素Ｄ测定法（附录Ⅶ K）测定 响应因子 取维生素Ｄ测定法（附录Ⅶ K）中的计算维生素D响应因子f1和计算前维生素D的响应因子f2的溶液适量，用正己烷稀释至每1ml中含维生素D3 0.625μg的溶液。 4