考马斯亮蓝G250.docVIP

　　本次蛋白质含量对比评测中，我们运用可溶性蛋白质含量测定的方法：《考马斯亮蓝G-250法(刘延林等，1998)》来进行两种样品的对比　　标准曲线的制作： 　　以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白质。称50mg考马斯亮蓝G-250溶于25mL 95%乙醇和50 mL 85%(w/v)的磷酸混合液中，用蒸馏水定容至500mL，快速滤纸过滤后储存于棕色瓶中备用。 　　称取100mg BSA，溶于蒸馏水中，定容至100mL，则其浓度为1000μg/mL。按表在6支具塞试管中分别加入BSA溶液和蒸馏水，配制成0～100μg/ml牛血清蛋白溶液各1ml，混匀后加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，盖塞、混匀，室温静置2min，用分光光度计在595nm处检测吸光度。以测得的吸光值为纵坐标，表中各管蛋白浓度为横坐标，做标准曲线。 蛋白质标准曲线溶液配制表 　　吸取待测样品1～5ml，放入具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置2分钟后用10mm光径比色杯在595nm下比色，记录其消光值，并通过标准曲线得到每毫升溶液中的蛋白质含量。 ? 　　样品蛋白质含量(mg/L)=标准曲线上求得的蛋白质含量(g)/测定取样体积(ml) 　　实验结果： 　　1 ，标准曲线与回归方程 ? 　　2 ，样品测定(稀释250倍) 　　计算后得出灭菌奶的蛋白值含量比值是：伊利金典/蒙牛特仑苏＝ 1. 2. 1　溶液的配制 标准蛋白溶液的配制:精确称取牛血清白蛋白 100 mg,用蒸馏水定容至100 mL,配成110 mg/mol 的标准溶液。 考马斯亮蓝G - 250溶液的配制:精确称取考马斯 亮蓝G - 250 100 mg,溶于50 mL 95%的乙醇,再加入 120 mL 85%的磷酸,稀释定容至1 000 mL备用。 1. 2. 2　乳制品中蛋白质含量的测定 分别准确移取一定量的乳与乳制品样品于试管 中,加入410 mL 考马斯亮蓝G - 250溶液,用蒸馏 水定容至510 mL,摇匀,在室温下反应5 min,以空 白(不加乳制品) 溶液作参比溶液, 分光光度计 595 nm波长处测定样品组的吸光度。 2　结果与分析 2. 1　工作曲线的确定 在试管中分别精确移取牛血清白蛋白标准溶液 0、011、012、014、016、018、110 mL, 加蒸馏水至 110 mL,然后在各支试管中分别加入410 mL 考马 斯亮蓝G - 250 溶液,摇匀,室温下反应5 min,在 595 nm波长处测定吸光度,以牛血清白蛋白标准溶 液浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘制标准曲 线。回归方程为Y = 01007 1X + 01008 9 (R2 = 01999 3) 。 表1　不同蛋白质标准溶液的吸光度 蛋白浓度 /g· (100 mL) - 1 0 0101 0104 0108 0112 0116 0118 吸光值0 01089 01157 01287 01435 01586 01718 2. 2　线性范围和检出限 工作曲线的蛋白浓度在0～0118 g/100 mL 范 围内符合比尔定律,线性关系良好。然后以试剂空 白值吸光度的3倍标准偏差计算检出限,检出限为 0102 g/100 mL;检出限的验证,添加检出限浓度空 白样加标,回收率达到9215 % ,偏差小于20 %。 2. 3　精密度试验 对6份乳与乳制品样品进行精密度试验,按照 1. 2. 2方法测定蛋白质的含量,结果表明蛋白质吸 光度的RSD为0189 %。 2. 4　稳定性试验 在同一乳与乳制品样品中加入410 mL 考马斯 亮蓝G - 250溶液,摇匀,在4 h内,每隔1 h测定1 次蛋白质含量,计算其RSD值。由试验结果可知, 同一乳品蛋白质含量的RSD为1140 % ,表明4 h内 溶液稳定性良好。 2. 5　重复性试验 取一定量乳与乳制品样品6份按1. 2. 2试验方 法进行检测,计算其蛋白质含量的RSD值。结果表 明蛋白质含量的RSD值为0195 %,表明其重复性 良好。 2. 6　加标回收试验 对2份生鲜牛乳、2份纯牛奶和酸酸乳、优酸乳 样品分别进行加标回收试验,每个样品浓度测定3 次,结果见表2。 表2　加标回收试验结果 样品号 本底量 /g 加标量 /g 测定均值 /g 回收率 /% 1 01035 2 01005 01038 7 9613 2 01038 4 01008 01044 8 9615 3 01030 6 01010 01041 8 10219 4 01031 1 01010 01042 0 10212 5 01012 5 01020 01031 2 9610 6 01011 3 01040 01048 7 9419