结核分枝杆菌DNA分子生物学检测临床诊断价值探讨.doc

结核分枝杆菌DNA分子生物学检测临床诊断价值探讨 探讨利用结核分枝杆菌的核酸扩增（PCR）技术，检测结核杆菌DNA在临床诊断中的价值。方法 采用病例对照研究方法，各组诊断采用双盲法，对健康对照组血标本，胸膜炎的胸水标本、腹膜炎的腹水标本、脑膜炎的脑脊液标本和有泌尿系症状的尿液标本，咳痰患者的痰标本进行PCR扩增及ABI—7300仪器荧光检测结核分枝杆菌DNA定量。应用统计学分析阳性率、敏感性、特异性及各组间的统计学意义。结果 共检测427例，其中初治涂阳肺结核100例，初治涂阴肺结核100例，肺外结核100例，肺部其他疾病77例，健康对照50例。结核杆菌DNA检测初治涂阳肺结核的阳性率86.0%、敏感性86.0%、特异性96.0%；阳性预测值97.7%、阴性预测值77.4%。初治涂阴肺结核的阳性率42.0%、敏感性42.0%、特异性96.0%；阳性预测值95.5%、阴性预测值45.3%。肺外结核的阳性率34.0%、敏感性34.0%、特异性96.0%。阳性预测值94.4%、阴性预测值42.1%。结论 结核分枝杆菌DNA分子生物学检测技术是对传统诊断活动性结核病实验室诊断方法的补充，具有较高的敏感性和特异性，对结核病的诊断有重要的诊断价值，成为结核病诊断和研究的重要手段。 【关键词】 肺结核；结核分枝杆菌；核酸扩增（PCR）；结核杆菌DNA 结核病的实验室诊断方法为结核分枝杆菌的痰涂片和改良罗氏培养法，然而，涂片的阳性率低、培养费时且阳性率不高。近年来，临床上应用聚合酶链反应（PCR）技术，进行结核分枝杆菌分子生物学检测，灵敏性及特异性高，为结核病的诊断提供了重要的诊断价值，现分析如下。 1 资料与方法 1.1 研究对象 病例组：选择2010-01-01/2010-12-31住院病例487例，其中男性263例，女性224例，年龄15~87岁。临床症状：咳嗽425例，咳痰368例，胸闷、气短187例，呼吸困难73例，胸痛98例，发热203例，乏力335例，消瘦139例，尿频、尿急、尿痛82例，腰部酸痛13例，头痛20例，腹痛34例，食欲差296例。入院时患者诊断均不确定。依据诊断标准，最后确定377例为病例组研究对象。健康对照组：同时选择医院50例健康人群设对照组，男5例，女45例，年龄21~55岁。 1.2 诊断标准 结核病诊断 [1] ：涂阳肺结核诊断病例符合下列条件之一者：（1）直接痰涂片镜检抗酸杆菌阳性2次；（2）直接痰涂片镜检抗酸杆菌阳性1次，且胸片显示有活动性肺结核病变；（3）直接痰涂片镜检抗酸杆菌阳性1次加结核分枝杆菌培养阳性1次。涂阴肺结核病例诊断要点：肺部有结核病变，直接痰涂片阴性或结核分枝杆菌培养阴性的肺结核，其诊断要点为：（1）具有典型肺结核临床症状和胸部X线表现；（2）抗结核治疗有效；（3）临床可排除其他非结核性肺部疾病；（4）BALF（支气管肺泡灌洗液）检出抗酸杆菌；（5）支气管或肺部组织病理检查证实结核性改变；（6）结核菌素（PPD5IU）皮肤试验强阳性，血清抗结核抗体阳性；（7）痰结核分支杆菌PCR探针检测阳性；（8）肺外结核部分病理检查证实结核病变或/和体液中抗酸杆菌阳性。肺外结核病包括结核性胸膜炎、结核性腹膜炎、结核性心包炎、结核性脑膜炎、颈部淋巴结结核、肾结核。非结核肺部疾病的诊断[2]包括肺炎、气管支气管炎、慢性阻塞性肺疾病。 1.3 实验方法　 1.3.1 留取标本 采集50份健康对照组血标本及采集治疗前患者各类临床标本，血标本146份、胸水标本67份、腹水标本30份、脑脊液标本8份、尿液标本82份，痰标本352份。 1.3.2 PCR法 TB-DNA 检测采用实时荧光定量PCR法。试剂盒为达安基因公司产品。取试验标本置于无菌密封瓶，加入等量4% NaOH消化液，静置30min，吸取1ml，12 000r离心5min，弃上清，加入DNA 提取液,100℃恒温处理10min，取上清2μl至PCR 反应管内,反应管置定量PCR 扩增仪(ABI 7300型) 内,按以下条件进行扩增:93℃→2 min 预变性,93 ℃45s→55 ℃60s10 个循环,93 ℃30 秒→55 ℃45 s30 个循环。 扩增过程中仪器实时检测荧光强度并分析增长曲线,根据Ct值计算出样本中TB-DNA 含量(基因拷贝数/ml )。阳性判定标准为:增长曲线呈典型S 型,最强荧光值较基础荧光值增高20单位以上。 1.3.3 抗酸杆菌检测 每日留取晨痰标本做浓缩集菌抗酸杆菌检测，连续3次。 1.4 统计分析方法 采用病例对照研究方法。依赖于四格表，进行计算[3]。率的比较采用X2检验。 2 结果 487例患者依据临床表现及相关辅助检查，最后确定诊断，并选择资料完整，