真核细胞传感器快速检测环境水样的DNA损伤效应.pdfVIP

真核细胞传感器快速检测环境水样的DNA损伤效应幸 张荣石丹张江华 江明 梅素容周宜开 吕斌 华中科技大学同济医学院环境与健康教育部重点实验室 湖北武汉430030 摘要：目的构建可检测外来化合物对真核细胞DNA损伤作用的真核细胞系作为真核细胞传感器， 用于筛选环境水样的DNA损伤作用．方法将对DNA损伤高灵敏的生长抑制和DNA损伤诱导基因 单克隆细胞株．发光检测已知致癌物和环境水样对稳定转染细胞的DNA损伤效应；同时RT-PCR检测 内源性GADDl53 相关分析表明二者具有良好的相关a(r2=0．9539)．该重组细胞株对已知环境致癌物以及实际水样的 DNA损伤效应有较高的诱导作用．结论该重组细胞株可用于检测痕量环境污染物的DNA损伤效应， 对实际水样的DNA损伤作用有较高的灵敏性． 关键词：HepG2细胞株重组水样筛选系统 DNA是生物体内的遗传物质，环境致癌物通过直接或间接作用造成的DNA损伤，是引起基因突变和细 诱导基因，虫荧光素酶作为报道基因，构建一株可以快速灵敏检测DNA损伤的真核细胞系，对已知致癌物 和实际混合水样的DNA损伤作用进行检测，评价其检测敏感度和遗传毒性检出阈，为环境中的致癌物筛选 提供一种新的方法。 1．材料与方法 1．1材料 剂盒(Promega公司)；trizol试剂盒，Lipofectamine G418(Life 型，美国)：凝胶成像分析系统(Vilber 司，LB9507型，美国)：荧光显微镜(Leica，德国)；XAD-2吸附树I猎(Sigma公司)。 1．2方法 (1)GADDl53．LUC质粒构建 StephenB．Howell惠赠；pGADDl53-EGFP经Kpn 片断，插入pGL3．Basic载体中，转化菌落酶切鉴定。 (2)实际水样制备 备用。 (3)细胞培养 37℃，5％C02培养。 “旗金项目：固家自然科学基金资助项目(NO，湖北省卫生厅资助项F-I(JXIB031)。 408 (4)细胞转染 G418 将GADD!气a．1…．1 2000共转染HepG2细胞：400弘g，L It和选择性质粒pEGFP—C2用Lipofecta_．mine 选择培养。无限稀释法稀释制备单克隆细胞。每个细胞克隆分别加入10斗mol／l氯化镉做为诱导剂，检测萤光 索酶活性，于其中挑选有诱导活性的细胞做进一步的培养及研究。 (5)细胞染毒和发光检测 2×105个细胞／ml的细胞悬液中。加入不同浓度的致癌物溶液，最高浓度以细胞存活率85％为上限，每 个浓度制3个平行样，对照组为相应的溶剂加入无血清的培养基。37C，5％C02继续培养24小时。染毒结 束后按荧光素酶测定试剂盒说明检测萤光素酶活性(每个样品重复检测3次，取平均值)，同时测定蛋白浓度。 酶活性表示用RLU／“g蛋白。 153mRNA的表达 (6)RT-PCR检测内源性GADD GADDl53．LUC细胞经CdCl2(0，1，5 RNA，M．MLV逆转录试剂盒合成第一链cDNA。PCR所用引物由上海博亚生物技术公司合成： 7 7--TCCTGTGGCATCCACGAAACT一3 13．actin上游引物：5 下游引物：57一GAAGCAmGCGGTGGACGAT--3’ 7 7一AACCAGCAGAGGTCACAAGC一3 GADDl53上游引物：5 7