负链反向遗传学.docVIP

负链RNA病毒的反向遗传技术* 曾江勇1，2，郭建宏1，刘在新1* (1.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃兰州 730046；2.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏拉萨 850000)? 摘　要：反向遗传技术是一种新的分子生物学技术，它在深入研究负链RNA病毒基因组结构和功能，探寻其基因组复制、转录和研发新型基因工程疫苗上发挥着重要的作用。文章介绍了分节与不分节负链RNA病毒的复制机理和特征，论述了反向遗传学在研究这些病毒上的策略、最新研究进展及其主要影响拯救效率的因素，进一步涉及了负链RNA病毒载体及其重组病毒的研究动态。因此，通过反向遗传学，人们将更加了解负链RNA病毒，为科学利用和有效控制该病毒奠定基础。 关键词：反向遗传学；负链RNA病毒；病毒载体 反向遗传(Reverse genetic)技术作为一项新型技术，是从克隆的cDNA产生感染性RNA病毒的过程，实现了在cDNA 水平上对RNA病毒的操作，从而为病毒的功能基因组研究提供了强有力的手段。相对来说，这项技术更易用于正链(Positive-strand)RNA病毒，从cDNA水平对其基因组进行操作，拯救感染性病毒。负链(Negative-strand，NS)RNA病毒，如埃博拉病毒、马尔堡病毒、汉坦病毒、拉沙病毒、克里木-刚果出血热病毒等，这些病原体由于存在独特的生物学特性，给病毒的拯救带来了一些困难，另外，它们引起的疫病具有发病率高和死亡率高的特点，因此，对负链RNA病毒的研究就显得尤为重要。目前已将反向遗传技术应用到该类病毒研究中去，在这些病毒基因组的结构和功能，表达调控机制以及致病机理等方面，产生了深远影响。 1　负链RNA病毒的复制机理 负链RNA病毒有7个病毒科[1]，即弹状病毒科、副黏病毒科、丝状病毒科、博尔纳病毒科、正黏病毒科、布尼病毒科和沙粒病毒科。其中，前4科病毒为不分节段的单股负链RNA病毒，后3科病毒为分节段的负链RNA病毒，分别含有6个～8个、3个、2个负链RNA片段。 无论是分节(segmented negative-strand，SNS)，还是不分节(non-segmented negative-strand，NNS)负链RNA病毒，都有共同的特性，它们都是包膜病毒，复制在胞质中进行，产生的mRNA是不经剪接的。正黏科病毒和博尔纳科病毒除外，它们转录和复制是在核仁中进行，有些mRNAs也需剪接。对传统mRNA正义链来说，负链RNA病毒基因组和“互补”基因组的RNAs是用核蛋白(N或NP)衣壳来包裹，共同转录形成螺旋对称N-RNA模板，与不同量的聚合酶蛋白(副黏病毒、弹状病毒、博尔纳病毒的大L蛋白和磷蛋白P，丝状病毒、爱博拉病毒的L、VP30、VP35，沙粒病毒和布尼病毒的L蛋白，流感病毒的PA、PB1、PB2)结合，构成一个最小的复制启动复合体(也称核糖核蛋白复合体，RNP)，一旦功能性RNP复合体形成，转录、复制、病毒增殖也就开始启动。 负链RNA病毒通过其病毒粒子表面的糖蛋白与宿主细胞的受体结合，随后发生病毒的囊膜与胞浆膜(pH非依赖性途径)或内体膜(pH依赖途径)的融合，然后将病毒的核糖核蛋白(RNP)复合体释放到细胞质中，RNP复合体由病毒RNA、核蛋白(它包裹着病毒RNA)以及病毒聚合酶复合物组成。在转录过程中，首先由病毒携带的RNA-RNA聚合酶从病毒基因组(－RNA)转录出mRNA，再翻译产生所需要的酶和结构蛋白；在复制过程中，转录出与病毒基因组长度一致的＋RNA，它可以作为模板合成病毒的RNA。大多数的负链RNA病毒是在被感染细胞的胞质中复制的，而波那病毒和正黏病毒则是在细胞核中复制的，因此对后者而言，RNP复合体以及新合成的NP和聚合酶蛋白必须运输到细胞核，而新合成的RNP复合体则是又从细胞核中运输到细胞质中，以便新合成的RNP复合体在细胞质膜上或高尔基复合体膜上与病毒的结构蛋白装配在一起，随后释放出新合成的病毒。 SNS-RNA病毒与NNS-RNA病毒明显区别是在它们的复制和mRNA转录机制上，SNS病毒的每节代表一个独立的转录、复制单位，每节3′末端、5′末端的核苷酸都是保守的，显示出部分反向互补性，这就导致了碱基对末端一起形成有功能的核心启动子，复制开始是从基因组(vRNA)和“互补”基因组(cRNA)的3′端到产生全长复制子为止。对NNS病毒来说，它们的转录开始仅仅在vRNA模板上，不履行此规则的是沙粒病毒和部分的布尼病毒科病毒[2]。 2　反向遗传技术在负链RNA病毒上的研究策略 无论是来自cDNA，还是合成的RNA，负链RNA病毒的拯救都不同于正链RNA病毒，具体表现在：(1)负链病毒复制开始需要蛋白质从头合成，此过程是受它们自己依赖于RNA的