20170216高致病性H7亚型流感病毒荧光RT-PCR检测方法.docVIP

附件 高致病性H7亚型流感病毒荧光RT-PCR检测方法 范围 本规定了TaqMan荧光RT-PCR 本适用于亚型流感病毒的快速检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法。 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫。 GB 19489 实验室生物安全通用要求。 GB/T 19438.1 禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 缩略语 荧光RT-PCR荧光反转录聚合酶链反应eal-time RT-PCR） HA 血凝素（Hemagglutinin） FAM 羧基荧光素Carboxyfluorescein ） DEPC 焦碳酸二乙酯（Diethypyrocarbonate）Ct/Cp值 反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数Threshold Cycle /Crossing Point） 原理 本在对序列比对的基础上，设计引物和荧光素标记的探针，建立了能够检测H7亚型流感病毒的荧光RT-PCR检测方法。 试剂和材料 试剂 除另有说明，所用试剂均为分析纯，所用液体试剂均需使用无RNA酶的容器进行分装。DEPC水：乙醇 PBS（含青霉素和链霉素）：配方见附录A。 荧光RT-PCR检测见附录B对照 ——阴性对照为SPF鸡胚尿囊液。 ——阳性对照为β-丙内酯灭活（4℃灭活72 h）的高致病性H7N9亚型流感病毒胚尿囊液培养物。Carrier RNA工作液的准备 裂解液在使用前需要按比例添加Carrier RNA，配制好后在2~8保存最多48h，（因此裂解液必须现用现配）。配制方法见下表。 Carrier RNA工作液配制表 样品个数 裂解液 Carrier RNA（μL） 样品个数 裂解液 Carrier RNA（μL） 1 0.21 5.9 6 1.26 35.4 2 0.42 11.8 7 1.47 41.3 3 0.63 17.7 8 1.68 47.2 4 0.84 23.6 9 1.89 53.1 5 1.05 29.5 10 2.10 59.0 注意：请将裂解液与Carrier RNA溶液颠倒混匀，即得到Carrier RNA工作液；为避免溶液出现气泡，请勿使用漩涡震荡Carrier RNA的使用对于有效回收两种病毒核酸是重要的。首先，Carrier RNA促进病毒核酸与二氧化硅膜的结合，特别是当样品中仅存在少量病毒核酸分子时；另外，当存在少量活性RNA酶分子的情况下，Carrier RNA能降低病毒RNA被降解的可能性。如果不向裂解溶液中加入载体RNA，可能导致病毒核酸收集量下降。 向缓冲液GD中加入无水乙醇。 仪器设备 荧光PCR检测仪及配套反应管（板）。 高速台式冷冻离心机（离心速度12 000 r/min）。 台式离心机。 器。 冰箱（2 ℃～8 ℃和-20 ℃两种）。 微量移液器（5 (L，10 (L，100 (L，1 000 (L）及配套吸头。 1.5 mL 离心管（无核酸酶）5 mL采样管。。 样品的采集与前处理 采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。 取样工具 棉拭子、剪刀、镊子、研钵、采样管、。 上述取样工具必须经121℃±2 ℃，15 min高压灭菌并烘干或经160 ℃干烤2 h。 样品采集 拭子样品 根据动物种类可分别采集咽喉拭子、泄殖腔拭子（禽类）或鼻拭子（猪）。采集方法如下： ——取咽喉拭子时将拭子深入喉头及上颚裂来回刮2次～3次并旋转，取分泌液； ——取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便； ——取鼻拭子时将拭子深入鼻腔来回刮2次～3次并旋转，取分泌物； 将采样后的拭子分别放入盛有.0 mL PBS（含青霉素和链霉素）的采样管中，编号。 肌肉或脏器样品 用无菌剪、镊采集待检脏器或肌肉组织，装入无菌采样袋或其它灭菌容器，编号。 样品贮运 样品采集后保温箱中加密封，24 h送实验室。样品处理 样品在器上充分混合后，将拭子中的液体挤出，3 000 r/min离心5 min，吸取上清液转入无菌的1.5 mL离心管中，编号备用。 取待检样品.0 g于研钵中充分研磨，再加10.0 mL PBS（含青霉素和链霉素）混匀，3 000 r/min离心5 min后，上清液转入无菌1.5 mL灭菌离心管中，编号备用。 样品存放 采集或处理好的样品在2 ℃～8 ℃条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，须放置-70 ℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。 荧光RT-PCR检测操作方法 实验室